Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB-42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,,laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine:
Tallinna Tehnikaülikool IMMUNOLOOGIA Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB41 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,, laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri, mis on kindla suurusega valkude segu (selle järgi teeme hiljem kindlaks enda uuritud valgu suuruse, kD).
Pesuvahendi kontsentraat Pesuvahendit on vaja: 5,5 ×30 Vesi 100 = 1,65ml Pipetid ja otsikud 5,5−2 ×1,55=2,4 ( ml ) 15ml falkon tuub 2,4 ÷ 0,2=12 1,5 ml tuubid PCR plaadi tükk Töö käik: Teen 15-ml falkon tuubi 5,5ml 30% homogeenset pesuvahendilahust Võtan kaks 1,5ml- tuubi ning pipeteerin mõlemasse 1,55ml lahust. Pipeteerin alles jäänud lahuse 200µl kaupa PCR plaadi aukudesse. Tulemus: Sain 7,5 auku täidetud, kuigi oleks pidanud jätkuma 12 tuubi jaoks. Viga tuli sellest, et detergenti pipeteerides jäid sisse õhumullid, mida tegelikkuses ei oleks tohtinud seal olla. II HARJUTUS Eesmärk: Õppida silma järgi hindama pipeteeritava koguse mahtu. Materjalid:
ta hakkab lagunema. EtBr seostub kaheahelalise DNAga ning uv-lainete all fluorestseerub oranžide viirgudena. (Suur oht! Mutageen!) Kui geel on piisavalt jahtunud, valasime geeli alusele (konstrollisime, et alus asetsetus horisontaalselt), tegime augu hammastega ning panime üleöö tarduma. 3.1 Praktikum – DNA lahutamine geelis Visualiseerime ona PCRi produkti selleks, et kontrollida, kas
pEGFP-C2. 2. PCR-i produkti puhastamine a) Kaalusime 1,5g agaroosi, viisime mahu TAE puhvriga 100ml-ni ja kuumutasime segu mikrolaineahjus, kuni agaroos täielikult lahustus. Seejärel jahutasime lahust ringjate liigutustega loksutades. Jahtunud segule lisasime 0,5l EtBr, loksutasime ning valasime lahuse geelialusele. Lasime geelil tarduda. b) Kuna produktide pikkus varieerus 300-2000 bp vahel, siis valmistasime 1,5% agaroos geeli. Mida pikemad produktid, seda lahjem peab olema geel, ning vastupidi. c) Kontrollgeeli valasime selleks, et hinnata, kas puhastamine on olnud efektiivne. Kui segusse on jäänud peale soovitava produkti muid jääke, on kontrollgeeli pildil näha peale õige pikkusega lõigu ka teisi bände. Kui aga geelil õige pikkusega bänd puudub, võib arvata, et puhastamise käigus on PCR-i produkt kadunud. Minu proov asub kolmandas positsioonis. Kontrollgeelilt on näha üks õige pikkusega (um 300 bp) lõik, mis näitab, et puhastamine on õnnestunud
mõneks ajaks tarduma. 52. IPTG-d on lac promootorit aktiveeriv reagent, X-gali on vaja, et bakterite elutegevuse käigus söötmes oli näha sinist pigmenti, antibiootikumi lisatakse, et oleks võimalik selekteerida välja bakterid, kuhu on sisse läinud plasmiid (edukalt transformeeritud elusad bakterid vastava antibiootikumi juuresolekul) 4. Pärast inkubeerisin transformatsioonisegu 90 sekundit 42 °C juures (heat shock) ning tõstsin tuubi 2 minutiks jääle (jahutamine) 5. Lisasin 500 μl LB vedelsöödet ning inkubeerisin kõik 30 minutit 37 °C juures termostaadis. 6. Fuugisin bakterid põhja 2 minutit. Tekkis sade rakkudest, mille pealt tuleb sööde ära valada. Tuubi jäi umbes 100 μl. 7. Pipeti abil kandsin bakterid Peetri tassile (tardunud söötmele) ning kuulikeste abil loksutasin bakterid ühtlaselt laiali. Asetasin tassid inkubaatorisse üleöö kasvama. Pärast säilitakse neid
...................................................................26 6. Anaeroobsete infektsioonide mikrobioloogiline diagnostika.................................................32 7. Spiroheetide,Neisseria, Chlamydia ja Mycoplasma infektsioonide diagnostika.................. .38 8. Seennakkused, algloomnakkused,zoonoosid ja riketsioosid………………………….....48 9. Molekulaarsed meetodid mikroorganismide samastamiseks ja iseloomustamiseks.............63 10. Elektroforees. Viroloogiline diagnostika.................................................................................71 2 Mikrobioloogilise diagnostika põhiskeem 1 A. Uuritav materjal Materjali valik toimub vastavalt haiguse patogeneesile, s.o. haigustekitaja võimalikule lokalisatsioonile organismis. B. Mikrobioloogiline diagnoosimine 1
annaabi.ee 
Sisene Facebook'ga
Sisene Google'ga
Sisene LinkedIn'ga
