P. Denticola. Prevotella multiformis P.multiformis P.denticola P.bivia P.melaninogenica Eskuliini hüdrolüüs - + - - API 20A: Sukroos + + - + Glütserool + + - - D-tsellobioos + - - - D-rafinoos + + - + API ZYM: -galaktosidaas - - - W -galaktosidaas + W + + -fukosidaas V W + + Prevotella multiformis P. multiformis P. denticola P. bivia P. melaninogenica API An-ident -glükosidaas - - - W -galaktosidaas - W W +
tarnskriptsiooni Induktsioon geeniprodukti süntees vastusena induktorile Operoni organisatsioon ja induktsioon E. coli lac operon: E. coli glükoosi metabolismi geenid ekspresseeritud pidevalt Alternatiivsete suhkrute metabolismi rada ekspresseeritud spetsiifiliselt (näit. Laktoos) Laktoos on disahhariid (glükoos+galaktoos), energiavehetuses Laktoos toimib kui induktor (effektor molekul) ja stimuleerib umbes 1000x ekspressiooni kolmele valgule: 1. galaktosidaas (lacZ) ·Lagundab laktoosi glükoosiks ja galaktoosiks ·Konverteerib laktoosi allolaktoosiks ja reguleerib lac operoni. 2. Laktoos permeaas (lacY) ·Transpordib laktoosi keskkonnast läbi plasmamembraani 3. Transatsetülaas (lacA) ·Päris täpselt funktsioni ei teata E. coli lac operon: Francois Jacob ja Jacques Monod (Pasteur'i Instituut, Pariis) Tegid kindlaks E. coli lac operoni organisatsiooni Nobeli preemia 1965.
Samuti tundus esmapilgul, et trüptofanaasne aktiivsus puudub minu uuritaval mikroobil. Siiski hakkas vaikselt tekkima veekihile õrnalt punakas alkoholkiht, kuigi see oli väga nõrk. Seega ei osanud täpselt hinnata, kas on olemas trüptofanaas või mitte. Indooltesti tuleks korrata, et veenduda täiesti ensüümi olemasolus. Minu tundmatul tüvel ei tuvastanud amülaasi, proteaasi ega kaseiini. -glükosidaas (eskuliin) ja -galaktosidaas andsid positiivse tulemuse. Arginiini dihüdrolaas, ureaas ja DNaasi testid olid negatiivsed. 5. kasv temperatuuril, NaCl kontsentratsioonidel ja pH-l 37 °C juures kasv puudus täielikult, kuid 42 °C juures esines. Maksimaalne soolataluvus oli 7% juures, kuid eelistas (kõige tugevam kasv) 0% juures kasvada. Kõige nõrgem kasv oli pH 3 juures ja tugevaim alates pH 9-st kuni 11-ni. 6. 16S rRNA geeni järjestus Kasutades BLAST andmebaasi ja tundmatu tüve 16S rRNA järjestust, sain lõpuks
Glükoamülaas ,, Glükoos + lõppdekstriinid Dekstrinaas ,, Glükoos Toimivad (14) glükosiidsidemetele Toimib (16) Glükosiidsidemetele OLIGOSAHHARIIDIDE HÜDROLÜÜS SAHHAROOS (Invertaas) GLÜKOOS + FRUKTOOS LAKTOOS (Laktaas e. -galaktosidaas) GALAKTOOS + GLÜKOOS MALTOOS (Maltaas) 2 GLÜKOOS Oligosahhariidide hüdrolüüs leiab aset peensooles. Vastavaid ensüüme produtseerivad soolte seintes olevad näärmed. GLÜKOLÜÜS (glycus- magus, lysis- lõhustumine, kr.k) Süsivesikutega kaetakse 50...60 % inimese energiavajadusest. Süsivesikute metabolism glükoosi metabolism · Glükoos on põhiline "kütus" enamike organismide jaoks
• Molekulaarbioloogia üks olulisemaid teemasid on – miks osa geene avalduvad ühtedes rakkudes/kudedes ja teised geenid teistes rakkudes/kudedes? • Kõige olulisem geeni avaldumise regulatsioon toimub transkriptsiooni tasemel. Geenide regulatsiooni tasemed Transkriptsiooni regulatsiooni uuringud said alguse E. coli bakteris Operonis on kolm geeni: Z, Y ja A. LacZ on b-galaktosidaas ehk ensüüm, mis lõikab laktoosi glükoosiks ja galaktoosiks. Lähedal asub LacI geen, mis kodeerib repressorvalku ja seondub Operaator regiooniga. Sellega blokeerib geenide ekspressiooni. Teisalt seondub hästi laktoosiga. Kui söötmes on laktoosi, siis vabaneb promootor ja LacZ geeni käivitub. Eukarüootse geeni regulatsioon Regulatoorsed DNA elemendid, kuhu seonduvad regulatsioonis osalevad valgud (transkriptsiooni faktorid jne)
44. Me kasutasime kloneerimiseks pSTBlue-1 vektorit (T-overhangidega), kuhu saab sisestada saadud DNA järjestuse (A-overhangidega inserdi 3’ otsades). Toimub A-T otste komplementaarne paardumine ning vektor ja DNA ligeeritakse. 45. 46. pSTBlue-1 vektor sisaldab replikatsiooni vajaliku origini, antibiootikumiresistentsuse geeni ning ka lacZ operooni, mis annab bakterile lisatoitumisallika, kuna kodeerib β-galaktosidaasi. β-galaktosidaas lõhub β1-4 glükosiidsidet ja erinevaid substraate ette söötes saame kindlaks teha, millised meie kasutatud bakterikoloonuatest sisaldavad tühja plasmiidi ja millistel on insert seda ensüümi kodeeriva järjestuse „ära rikkunud“. 47. Ligeerimiseks tuleb pipeteerida kokku ligeerimissegu (5 μl), segada pipeti või vorteksi abil, vajadusel fuugida ning jäta ligeerimiseks järgmise päevani +4 °C juures. Ligeerimissegu: 1 μl puhastatud PCRi produkti
reguleerimine; 6)Valgu post-translatsiooniline modifitseerimine (aktiivsuse reguleerimine). VALGU BIOSÜNTEESI REGULATSIOON TRANSKRIPTSIOON TASEMEL - Laktoosi operon e lac operon kui "negatiivse kontrolli" näide. Operon lähedaste funktsioonidega geenide rühm, mille transkriptsioon ja reguleerimine toimub ühtse blokina; tüüpiline prokarüootsetele rakkudele. Lac operon sisaldab kolme laktoosi metaboliseerimiseks vajalikku valku (ensüümi) kodeerivat struktuurgeeni: ß-galaktosidaas e laktaas, laktoosi permeaas, tiogalaktosiidi transatse tülaas (siin atsetülaas). Regulaatorgeen kooderib valku, mis lac operonis toimib kui repressor. Kontrollivad järjestused kontrollivad struktuurgeenide transkriptsiooni, paiknevad neist "üles voolu". Promootor RNA polümeraasi siduv järjestus. Operaator repressorvalku siduv järjestus. Valgu Mutatsioonide tulemusel võib geeni nukleotiidne järjestus muutuda. Punktmutatsioon - ühe nukieotiidi vahetumine või
rakukolooniate tuvastamiseks sini-valge meetodit. Lisaks sellele on vektoris palju erinevaid restriktsioonisaite, see võimaldab vektorisse sisestada erinevate restriktaasidega töödeldud otstega inserte. d) Plasmiid sisaldab lacZ operoni, mis kodeerib -galaktosidaasi. Kui kasvusöötmele lisada X-gali (laktoosi analoog, kus galaktoosiga on glükoosi asemel seotud inool), siis rakkudes, kus lacZ lugemisraam on terve, hüdrolüüsib -galaktosidaas X-galis glükosiidsideme, vabanevad galaktoos ja 5-bromo-4-kloro-3-hüdroksüindool, millest viimane dimeriseerub ja oksüdeerub tekib indigosinist värvi dikloro-dibromo-indigo, mis värvib indigosiniseks terve koloonia. Kui lacZ operoni sisestada insert, siis see rikub (suure tõenäosusega) lacZ operoni lugemisraami, -galaktosidaasi ei ekspresseerita, eelkirjeldatud protsessi ei toimu ning kolooniad jäävad valged.
Kui hiljem vaadata, siis kasvukeskkonnas olevate teiste substraatide aluselised laguproduktid varjutavad tekkinud happelise reaktsiooni 10. Mis on IMViC test ja milliste mikroobide eristamisel on ta oluline? Enterobaktereid tuvastav testide seeria. 11. Mis tähtsus on eksoensüümidel ja nimeta neid? Eksoensüümid – bakterite produtseeritud ensüümid, mis lagundavad väljaspool rakku olevad polümeersed orgaanilised ühendid. Proteaas, esteraas, glükosidaas, galaktosidaas, trüptofanaas, arginiini dihüdrolaas, amülaas, DNaas, tsellulaas. 12. Millisesse ensüümide klassi kuuluvad eksoensüümid? Hüdrolüütilised ensüümid. 13. Mille järgi on võimalik määrata mikroobi trüptofanaasset aktiivsust? Indooltestiga. Trüptofaan lagundatakse indooliks. Kasutatakse lisaks Kovacsi reaktiivi. Erepunane värvus. Kasutatakse LB söödet. Indooli kuhjub ja seda ei metaboliseerita. 14. Mida peab sisaldama indooltesti tegemiseks kasutatav sööde? Trüptofaani. 15
bakterid. Coli-laadsete bakterite defineerimisel ei ole aluseks võetud taksonoomilised kriteeriumid, vaid nimetatud bakterite rühma määramisel kasutatavad söötmed ja inkubeerimistingimused. Terminiga Coli-laadsed tähistatakse bakterite rühma, kes inkubeerimisel 48 tunni jooksul temperatuuril 36 ± 2 ºC kääritavad laktoosi, tootes hapet ja gaasi. Nad kõik sisaldavad ensüümi ß-galaktosidaas ja on gram- negatiivsed, oksüdaasnegatiivsed, aeroobid või fakultatiivsed anaeroobid, paljud neist on liikuvad, endospoore mittemoodustavad pulgakujulised bakterid, peamiselt perekondade Escherichia, Enterobacter, Klebsiella ja Citrobacter esindajad. Kuna nimetatud bakterid on looduses laialdaselt levinud, ei ole coli-laadsete bakterite grupp seega spetsiifiline fekaalse saastatuse näitaja. Normid pinnasevesi
Geen-valk. Valkude isovormid: transkriptide splaissingu alternatiivsed ainevahetusalad (lähedasi omadusi omavad ensüümid/valgud). Üks geen võib moodustada perekonna lähedasi valke eksonite alternatiivse splaissingu tulemusel. "Viga parandab vea" - geenisisene komplementatsioon. Kahe samas geenis asuvate mutatsiooni mõjul moodustub normaalne fenotüüp. Polaarne mutatsioon - mutatsioon, mis takistab endast allavoolu (tavaliselt?) olevate geenide avaldumise. LacZ, beta-galaktosidaas; lacY, beta-galaktosiid permeaas - moodustub multigeenne mRNA, mis annab translatsioonil need 2 ensüümi. Polaarne mutatsioon ei komplementeeru isegi siis mitte kui teine mutatsioon on samas geenis.
Oksüdatiivsed reaktsioonid toodavad NADH-d, mis võidakse reoksüdeerida TCA tsüklis või käärimisproduktide tekkega. Glükoos + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ 2püruvaati + 2ATP + 2NADH + 2H+ Arhedel ei esine tüüpilist glükolüüsi. Neil on modifitseeritud glükolüüs, milles heksokinaasi- ja fosfofruktokinaasireaktsioonis osaleb fosforüüli doonorina mitte ATP vaid kas ADP või pürofosfaat. Erinevad suhkrud lülituvad glükolüüsi erinevalt: Laktoos laktoos glükoos + galaktoos (beeta-galaktosidaas) Galaktoos galaktoos + ATP galaktoos-1-P + ADP (galaktokinaas) Gal-1-P Glc-1-P Glc-1-P Glc-6-P (fosfoglükomutaas) Maltoos maltoos 2Glc (maltaas) Sahharoos sahharoos Glc + Fru (invertaas) Sahharoos on üks oluline suhkur etanooli tootmisel bakterite vahendusel. Ka pärmis kääritavad sahharoosi etanooliks. Oksüdatiivne pentoosfosfaaditsükkel (PPC) PPC rajas toimub heksooside oksüdatsioon pentoosfosfaatide moodustumisega
puhul. Polaarse mutatsiooni puhul mõjutab mutatsioon mitte üksnes selle geeni avaldumist, milles ta asub, vaid mõjutab ka temaga külgnevate geenide avaldumist. Need geenid paiknevad mutatsiooni sisaldavast geenist alati ühes kindlas suunas sellest ka mutatsiooni polaarne toime. Näiteks bakterirakus paiknevad paljud struktuurgeenid operonina. Laktoosioperoni puhul paiknevad geenid lacZ (kodeerib laktoosi lagundavat ensüümi -galaktosidaas) ja lacY (laktoosi permeaas järjekorras: lac-promootor lacZ lacY. Juhul, kui lacZ geeni algusosas tekib mutatsioon, mis tekitab sinna translatsiooni stop koodoni, mõjutab see oluliselt ka geeni lacY translatsiooni efektiivsust. 12. Käitumise geneetiline kontroll Käitumine on koordineeritud neuromuskulaarne vastus keskkonna signaalidele, milles osalevad nii sensoorsed, neuraalsed kui ka hormonaalsed faktorid.
oli võimeline katalüüsima 100 000 kordse enda massi sahharoosi hüdrolüüsi. Sahharoos+vesi=glükoos+fruktoos Ensüümid on väga spetsiifilised. Glükoosi molekul (-all, -üleval, peal, teise C juures on OH all, 3 juures üleval, 4 juures all ja 5 C juures on CH2OH). -galaktoos on samasugune, aga 4 juures on OH üleval. -glükosidaas katalüüsib reaktsioone glükoosi derviaatidega, galaktoosi derivaate aga ei aktsepteeri. Galaktosidaas aga tunneb ära galaktoosi derivaate. Ensüüm on nagu lukk ja substraat on nagu võti, sellest ka kõrge spetsiifilisus. Luku-võrme teooria: seletus ensüümide kõrgest spetsiifilisusest. Üks lukk ja teine võti, mis sobituvad ideaalselt. Ei seleta katalüüsi siiski! Henri pani paika ES kompleksi idee keemiliselt ja matemaatiliselt korrektsetel alustel. Michaelis-Menten-(Henry) (MM) 10 Kaasaegse ensümoloogia rajajad
Polaarse mutatsiooni puhul mõjutab mutatsioon mitte üksnes selle geeni avaldumist, milles ta asub, vaid mõjutab ka temaga külgnevate geenide avaldumist. Need geenid paiknevad mutatsiooni sisaldavast geenist alati ühes kindlas suunas sellest ka mutatsiooni polaarne toime. Näiteks bakterirakus paiknevad paljud struktuurgeenid operonina. Laktoosioperoni puhul paiknevad geenid lacZ (kodeerib laktoosi lagundavat ensüümi -galaktosidaas) ja lacY (laktoosi permeaas järjekorras: lac-promootor lacZ lacY. Juhul, kui lacZ geeni algusosas tekib mutatsioon, mis tekitab sinna translatsiooni stop koodoni, mõjutab see oluliselt ka geeni lacY translatsiooni efektiivsust. Komplekssed seosed geenide ja polüpeptiide vahel Geenide ja polüpeptiidide kolineaarsus ei pruugi selle algses tähenduses alati kehtida. 1960-ndate aastate lõpus kirjeldati viirustel geenide kattuvust. Kattuvate geenide puhul peab arvestama, et osa samast
Polaarse mutatsiooni puhul mõjutab mutatsioon mitte üksnes selle geeni avaldumist, milles ta asub, vaid mõjutab ka temaga külgnevate geenide avaldumist. Need geenid paiknevad mutatsiooni sisaldavast geenist alati ühes kindlas suunas sellest ka mutatsiooni polaarne toime. Näiteks bakterirakus paiknevad paljud struktuurgeenid operonina. Laktoosioperoni puhul paiknevad geenid lacZ (kodeerib laktoosi lagundavat ensüümi -galaktosidaas) ja lacY (laktoosi permeaas järjekorras: lac-promootor lacZ lacY. Juhul, kui lacZ geeni algusosas tekib mutatsioon, mis tekitab sinna translatsiooni stop koodoni, mõjutab see oluliselt ka geeni lacY translatsiooni efektiivsust. Komplekssed seosed geenide ja polüpeptiide vahel Geenide ja polüpeptiidide kolineaarsus ei pruugi selle algses tähenduses alati kehtida. 1960-ndate aastate lõpus kirjeldati viirustel geenide kattuvust. Kattuvate geenide puhul peab arvestama, et osa samast
Arvestades asjaolu, et bakteri nukleoidi tertsiaarstruktuur muutub kasvu kiirusest sõltuvalt (vt peatükki Bakterite ehitus ja rakustruktuuride funktsioonid), siis geenide regulatsioon võib muutuda ainult kromosoomi erinevast pakkimisest kasvufaasiti. Teine võimalus, regulaator difundeerub märklaudjärjestuseni. Jälgiti Caulobacter crescentus'e groESL operoni geenide (ATP-st sõltuvad saperonid, mis aitavad struktuurvalkudel õigesti pakkuda) ja E. coli's geeni lacZ (- galaktosidaas) mRNA-de liikumist rakus fluorestsents-märkega hübridiseerimise abil in situ (ladina keeles, tähendab ,,koha peal"). Esmalt saadi tulemus, et mRNA-lt toimub translatsioon DNA lähedal, mis näitab valkude ruumilist eraldatust bakteris. Valku sünteesitakse geeni lähedal. Sellisel juhul tekib küsimus, kuidas regulaatorid saavad aktiveerida ruumiliselt kaugel asuvaid geene. Kuumasoki korral võimendub groESL operoni geenidelt valkude
annaabi.ee 
