Ensüümid Kõrgmolekulaarsed bioloogilised katalüsaatorid Interaktsioonid Valgusüntees Mitmeasteline protsess Ribosoomid Valkude eraldamise meetodid Väljasoolamine erinevad valgud sadestuvad erineva soolakontsentratsiooni juures Dialüüs eraldamine läbi poolläbilaskva membraani Geelfiltratsioonkromatograafia suuremate ja väiksemate molekulide erinev liikuvus läbi geeli Ioonivahetuskromatograafia laenguga valkude seondumine kolonni Afiinsuskromatograafia valkude afiinsus spetsiifiliste keemiliste rühmade suhtes Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia Valkude keemilised omadused Valkude denatureerumine-pöördumatu muutmine Küsimused Mis on valgud? Mis on valkude ülesanne? Mis on kõige suurem valk? Mis on valkude denatureerumine? Mis on saperonid? Sõnaseletused Dalton-aatommassiühik Saperonid-tugivalgud Aminohapped-orgaanilised uhendid Geenitranskriptsioon-ümberkirjutis/kujutis
statsionaarseks, faasi vahel. Mobiilse faasi agregaatolekust sõltuvalt eristatakse gaasi-, vedelik- ja ülekriitilise fluidumi kromatograafiat. Statsionaarse faasina võib kasutada adsorbenti, ioniiti, biospetsiifilist sorbenti, poorset geeli või kandja pooridesse seotud vedelikku. Sõltuvalt statsionaarse faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest eristatakse järgmisi kromatograafia liike: · jaotuskromatograafia, · adsorptsioonkromatograafia, · afiinsuskromatograafia, · ioonvahetuskromatograafia, · geelkromatograafia. Kromatograafiat kasutatakse lipiidi, süsivesikute, valgude, aminohappete jt biomolekulide lahutamiseks.Kromatograafiat võib teha kas kinnises süsteemis kolonnis(kolonnkromatograafia), või lahtises süsteemis paberil või kromatograafilisel plaadil(nt. planaarkromatograafia). Pole vaja siin korrata juhendit! Jaotuskromatograafia aluseks on lahutuvate ainete jaotumine kahe mitteseguneva vedelikule
Suurendades tsentrifuugi kiirust on võimalik katseklaasi põhja viia järjest väiksemaid osakesi. Diferentsiaalfuugimine kaks või enam fuugimist erinevatel tingimustel. Gradientfuugimine teostatakse saharoosis või soolagradiendis. (Sedimentatsioonikoefitsent S = 10-13 sek. 2. Ioonvahetuskromatograafia, hüdrofoobsuskromatograafia, geelfiltratsioon-kromatograafia, afiinsuskromatograafia. Vedelikkromatograafias toimub eraldamine valgumolekulide erinevaid füüsikalis-keemilisi omadusi kasutades. Ioonvahetuskromatograafia eraldamine vastavalt valkude laengule. Hüdrofoobsuskromatograafia vastavalt valkude hüdrofoobsusele. Geelfiltratsioon-kromatograafia vastavalt valgumolekuli suurusele. Afiinsuskromatograafia vastavalt interaktsioonidele. 3
statsionaarseks, faasi vahel. Mobiilse faasi agregaatolekust sõltuvalt eristatakse gaasi-, vedelik- ja ülekriitilise fluidumi kromatograafiat. Statsionaarse faasina võib kasutada adsorbenti, ioniiti, biospetsiifilist sorbenti, poorset geeli või kandja pooridesse seotud vedelikku. Sõltuvalt statsionaarse faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest eristatakse järgmisi kromatograafia liike: · jaotuskromatograafia, · adsorptsioonkromatograafia, · afiinsuskromatograafia, · ioonvahetuskromatograafia, · geelkromatograafia. Kromatograafiat kasutatakse lipiidi, süsivesikute, valgude, aminohappete jt biomolekulide lahutamiseks.Kromatograafiat võib teha kas kinnises süsteemis kolonnis(kolonnkromatograafia), või lahtises süsteemis paberil või kromatograafilisel plaadil(nt. planaarkromatograafia). Põhilised kromatograafia metodid: · Jaotuskromatograafia · Kolonnkromatograafia · Geelkromatograafia
Tsentrifuugimisega on võimalik eraldada osakesed, mis erinevad massi või tiheduse poolest. Suurendades tsentrifuugi kiirust on võimalik katseklaasi põhja viia järjest väiksemaid osakesi. Diferentsiaalfuugimine – kaks või enam fuugimist erinevatel tingimustel. Gradientfuugimine – teostatakse sahharoosis või soolagradiendis. (Sedimentatsioonikoefitsent S = 10-13 sek. 2. Ioonvahetuskromatograagia, hüdrofoobsuskromatograafia,geelfiltratsioon-kromatograafia, afiinsuskromatograafia Kromatograafia on laboritehnika molekulide eraldamiseks. Eraldab molekule nt valke, mis on jaotunud mobiilse ja stratsionaalse faasi vahel. Eluaat on mobiilne faas, mis liigub mingis kindlas suunas. Eulaat, mis sisalad analüüsitavat ainet on eluent. Mobiilne faas võib olla gaas või vedelik. Eraldamine toimub valgu erinevaid omadusi kasutades: a) ioonvahetuskromatograagia- vastavalt valkude laengule b) hüdrofoobsuskromatograafia- vastavalt valkude hüdrofoobsusele
.. (?) Kümotrüpsiin ja trüpsiin – proteolüütilised valgud, mis lõikavad peptiidsidet spetsiifilise aminhappe C-terminaalsest otsast. Kümotrüpsiin lõikab aromaatsete kõrvalahelatega aminohapete juurest; trüpsiin positsiivset laengut kandvate aminohapete juurest. Spetsiifiline aktiivsus – ensüüm katalüüsib talle spetsiifilist reaktsiooni ja spetsiifiliste molekulidega?. Nt. eksonukleaasne aktiivsus, peptidaasne aktiivsus? Geelfiltratsioon Ioonvahetuskromatograafia Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis. Isoelektriline fokuseerimine – elektroforeesi geeli on moodustatud pH gradient; sellel geelil
Eluent - kus lahustub analüüt. Kasutatakse bioloogiliste molekulide lahutamisel, molekulkaalu määramisel. Kolonni täidise poorsus varieerub ja väga suured molekulid ei mahu pooridesse, seetõttu elueeritakse ruttu välja,väikesed molekulid difundeeruvad pooridesse ja nad elueeruvad välja analüüsi lõpus, vahepealse suurusega molekulid sisenevad suurtesse pooridesse ja väikestesse pooridesse nad ei mahu ning nende retsensiooniaeg on suurte ja väikeste molekulide vahepealne. 33. Afiinsuskromatograafia Tahke kandjaga on seotud kovalentselt ligand, mis selektiivselt seob teatud proovi komponente. Ülejäänud proov elueerub kolonnis sorbeerumata. Seotud ühendid elueeritakse puhvriga, millel on suur soola konts. või kõrge pH väärtus. Kasutatakse ensüümide, valkude ja peptiidide puhastamisel, viiruste ja rakkude isolatsioonil. 34. Detektorid VK-s (koos lühikirjeldusega) - Murdumisnäitaja detektor - madal selektiivsus - madal tundlikkus - kui analüüdi
kromatograafiat. Statsionaarse faasina võib kasutada adsorbenti, ioniiti, biospetsiifilist sorbenti, poorset geeli või kandja pooridesse seotud vedelikku. Sõltuvalt statsionaarse faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest erista- takse järgmisi kromatograafia liike: · jaotuskromatograafia, · adsorptsioonkromatograafia, · afiinsuskromatograafia, · ioonvahetuskromatograafia, · geelkromatograafia. Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt aminohapete, valkude, süsivesikute, lipiidide jt biomolekulide segude lahutamisel. Kromatograafia liike illustreerivad skeemid Kromatograafilist protsessi võib realiseerida kinnises süsteemis kolonnis (kolonn- kromatograafia) ja lahtises süsteemis paberil või kromatograafilisel plaadil (üldnimetus
Suuremad osakesed jõuavad kolonnist enne välja. 2) Kemosorptsioonkromatograafia tekivad keemilised reaktsioonid aine, sorbendi ja eluendi vahel, mis võivad olla pöördumatud või pöörduvad. ioonvahetuskromatograafia ioonvahetuskolonniga võimalik ioniseeruvaid aineid lahutada. Kolonni liikumatu faasi pind sisaldab nt. katioone. Need tinglikult hoiavad kinni anioone. Mida paremini hoitakse anioone kinni, seda aeglasemalt anioon liigub. afiinsuskromatograafia seda kasutatakse enamasti bioloogiliste objektide korral. Antikehad seotakse liikumatule faasile. Kolonnist lastakse veri läbi. Antikeha seondub vastava molekuliga ja see seotakse kolonni. Järgmises faasis elueeritakse sobiva solvendiga. Eelis on see, et on väga tundlik ja spetsiifiline. Võib olla 500 erinevat molekuli, aga ainult 1 molekuli suhtes afiinne ning seda on võimalik eraldada. Aga seda meetodit kasutatakse vähe, vaid teatud bioloogiliste proovide korral.
Mobiilse faasi agregaatolekust sõltuvalt eristatakse gaasi-, vedelik- ja ülekriitilise fluidumi kromatograafiat. Statsionaarse faasina võib kasutada adsorbenti, ioniiti, biospetsiifilist sorbenti, poorset geeli või kandja pooridesse seotud vedelikku. Sõltuvalt statsionaarse faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest eristatakse järgmisi kromatograafia liike: jaotuskromatograafia, adsorptsioonkromatograafia, afiinsuskromatograafia, ioonvahetuskromatograafia, geelkromatograafia. 2. Selgitage geelkromatograafia meetodi põhimõtet. Geelkromatograafia e geelfiltratsioonkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine e fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Meetodit tuntakse ka molekulaarselte, aga samuti eksklusioonkromatograafia nime all. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide (bio- või tehispolümeerid) lahutamiseks,
On selge, et paljud molekulid, mille bioloogiline tähendus on erinev võivad oma üldsitel füüsikalis- keemilistel olla väga sarnased. Tavalise geelkromatograafia abil neid üksteisest puhastada ei saa. Andes kolonnidele mingeid erilisi omadusi on see siiski võimalik. Andes geeljale ainele elktrilaengu, siis kolonnist liiguvad läbi ainult need molekulid, millel on vastav laeng. Nüüd saame eristada molekule mitte ainult nende suuruse vaid ka laengu järgi ioonivahetus kromatograafia. Afiinsuskromatograafia puhul on kolonn täidetud geeliga, millel on väga spetsiifilised omadused. /Dna polümeraas seondub igal juhul DNA'ga. Oletame, et teeme kromatograafilise eksperimendi, aga selle kolonni täiematerjali kulge seondame üheahelalise DNA molekuli. Pannes kolonni peale segu erinevatest ainetest, mis rakust saime, siis kõik molekulid jooksevad kolonnist läbi, kuid DNA polümeraas jääb kolonni kinni, kuna ta seonudus DNA'ga
mitmeid epitoope. Monoklonaalsed antikehad on spetsiifilised üksiku epitoobi suhtes, mistõttu peetakse neid märklaud-antigeeni suhtes enam spetsiifilisemaks kui polüklonaalseid antikehi Raku komponentide eraldamine tsentrifuugimise teel. Sade koguneb põhja,supernatant peale Raku komponentide eraldamine pideva ja astmelise tihedusgradiendi abil. Valkude kromatograafilise lahutamise kolme erineva viisi (ioonvahetus-, geelfiltratsioon- ja afiinsuskromatograafia) põhimõte. Ioonvahetuskromatograafia – positiivselt laetud kerakestele seostuvad negatiivselt laetud molekulid. Positiivselt laetud molekulid ei seostu ja tulevad kolonnist läbi. Geelfiltratsioonkromatograafia – väiksed molekulid takerduvad poorsetesse kerakestesse, suured läbivad kolonni vabalt. Afiinsuskromatograafia – keraksetega kovalentselt seotud molekulidele seostuvad neile spetsiifilised molekulid. SDS-polüakrüülamiidgeel elektroforeesi tööpõhimõte.
liikuvusel mobiilsest ja statsionaarsest faasist koosnevas süsteemis. Kromatograafilise ainete eraldamise eesmärgiks võib olla üksikute komponentide kättesaamine, et nendega midagi edasi teha (nt kasutada ravimi koosseisus). Sellist kromatograafiat nimetatakse preparatiivseks. Biomolekulide puhastamisel on kasutusel näiteks: · ioonvahetuskromatograafia · õhukese kihi kromatograafia · pöördfaaskromatograafia · geelfiltratsioonkromatograafia · afiinsuskromatograafia Elektroforees põhimõte: valkude lahutamine liikuvuse alusel poorses keskkonnas elektrivälja toimel. Osakese elektroforeetiline liikuvus elektriväljas sõltub elektrilisest potentsiaalist ja osakese summaarlaengust. Kuna erinevatel valkudel on samades tingimustes erinev summaarlaeng, lahutuvad nad elektriväljas. Levinum on tahkel kandjal toimuv tsonaalne elektroforees. 11. Nukleotiidid. Nukleotiidid on nukleiinhappe monomeerid. Nad on nukleosiidide mono-, di-, või trifosfaatestrid
molekulid ära eksivad. Väiksemad valgumolekulid mahuvad nende pooride ja kanalite sisse ning satuvad otsekui lõksu, kust ekseldes väljajõudmiseks kulub palju aega. Suuremad molekulid seevastu terakeste sisse ei mahu ja liiguvad läbi terakestevahelise ruumi kiiresti kolonnist välja. Selleks ajaks, kui ka väikesed valgud kolonnist välja hakkavad jõudma, on suured kolonnist ammu lahkunud ning jällegi on saavutatud osade valkude eraldamine teistest. Afiinsuskromatograafia- huvipakkuv valk võib mõnda väikest molekuli (nn.ligandi) väga tugevasti ja spetsiifiliselt siduda (s.t. teised valgud seda molekuli ei seo). Sünteesitakse resiin, mille küljes see molekul on ning voolutatakse valkude segu läbi resiini nagu teiste kromatograafialiikide puhul. Kolonni jääb kinni ainult meid huvitav valk. Nüüd muudetakse kas lahusti pH-d (valk-ligand seondumine sõltub lahuse pH-st) või lisatakse lahusesse mõnda teist ligandi, mis seondub valguga samast kohast, kus
sattuvaid poore ning väljuvad kolonnist nende suuruse poolt määratud järjekorras. Mida vähem on statsionaarse faasi ja analüüdi vahel keemilisi ja füüsikalisi interaktsioone, seda efektiivsem on kolonn. Suuruskromatograafias eksisteerib maksimaalne ja minimaalne võimalik retentsiooniaeg (olenevalt sellest, kas osakesed läbivad kõikvõimalikud sorbendi poorid või liiguvad ümber sorbendiosakeste). 115. Afiinsuskromatograafia põhimõte. Tahke kandjaga on seotud kovalentselt afiinsusligand (biokeemiline ühend), mis selektiivselt seob teatud proovi komponendid. Ülejäänud proov elueerub kolonnis sorbeerumata. Väga suur selektiivsus, mis on kasulik preparatiivseks tööks. Tahked kandjad on hüdrofoobsed: agaroos, tselluloos, polüakrüülamiid. Ligandid: ensüümid, antikeha. Seotud ühendite elueerimine: ligandi lahuse abil.
Kasutatakse polüklonaalseid või monoklonaalseid antikehi. Polüklonaalsed antikehad toodetakse katselooma korduval immuniseerimisega puhastatud antigeenidega. Katseloomal areneb tugev immuunvastus, mis annab kõrge afiinsusega ja ja spetsiifilisusega antikehad. Need antikehad on erinevate parameetritega, tunnevad ära erinevaid epitoope samal antigeenil. Katseloomalt kogutakse seejärel korduvalt seerumit, millest eraldatakse afiinsuskromatograafia abil välja meid huvitavad antikehad. Nii saab toota ka antikehade vastaseid antikehi, nt kui küülikut immuniseerida inimese IgG fraktsiooniga. Nii saab toota inimese IgG vastaseid küüliku polüklonaalseid antikehi. Monoklonaalseid antikehi saab ühe raku kloonimisega. Katselooma immuniseeritakse korduvalt puhaste antigeenidega. Põrnast eraldatakse B- lümfotsüüte, mida stimuleeritakse paljunema ja antikehi tootma vastava antigeeni vastu. Kuna B-
annaabi.ee 
