VK protokoll (0)

TTÜ keemiainstituut



TTÜ keemia ja biotehnoloogia instituut YKA0060  Instrumentaalanalüüs Vedelikkromatograafia Kofeiini ja teobromiini määramine jookides kasutades vedelikkromatograafiat Õpperühm: Töö teostaja:  Õppejõud:   Töö teostatud:   


1 Töö eesmärk
Eesmärgiks on määrata kofeiini ja teobromiini kontsentratsioon joogis (antud juhul
rohelises tees) vedelikkromatograafia meetodil. 2 Töö käik Uuritav proov: ROHELINE TEE 1. Valmistada standardlahused (dest. vees) kontsentratsiooniga 3, 10, 15 ja 30  μg/mL (ruumala 1mL)g/mL (ruumala 1mL)  3 μg/mL (ruumala 1mL)g/mL: 0,1 mL lahust + 0,9 mL vett  10 μg/mL (ruumala 1mL)g/mL: 0,3 mL lahust + 0,7 mL vett  15 μg/mL (ruumala 1mL)g/mL: 0,5 mL lahust + 0,5 mL vett  30 μg/mL (ruumala 1mL)g/mL: 1 mL lahust  2. Kaaluda 2 g teed keeduklaasi, lisada 150mL kuuma vett ja lasta jahtuda  toatemperatuurini. Seejärel pipeteerida 1 mL Eppendorf’i sisse ja 
tsentrifuugida 5-7 min. 3. Lahjendada tsentrifuugitud proovi 5x ja tsentrifuugida veel kord. Filtreerida  süstalfiltriga. 4. Programmeerida aparatuuri tarkvara vastavalt parameetritele, jooksutada  eluneti baasjoone stabiliseerumiseni. 5. Pesta dosaatori aas dest. veega ja viia läbi katse standardlahustega (kaks  paralleeli iga kontsentratsiooniga). Alustada väiksemast kontsentratsioonist. 6. Pesta dosaatori aas dest. veega ja viia läbi katse lahjendatud ja filtreeritud  teega (kaks paralleeli). Vajadusel lahjendada veel. 3 Tulemused 3.1 Kalibratsioonigraafiku ehitamine Märkus 1: Kontsentratsiooni 3 μg/mL kohta oli tehtud kolm paralleeli, millest kaks g/mL kohta oli tehtud kolm paralleeli, millest kaks 
ebaõnnestusid, seega kalibreerimiseks on kasutatud ainult ühte. Kontsentrastioon, μg/mL (ruumala 1mL)g/mL Piigi pindala@273nm Teobromiin Kofeiin 3 170,6 163 3 vt märkus 1 vt märkus 1 Keskmine väärtus 170,6 163 Standardhälve 0 0 2


10 544,1 530,8 10 530,8 528,7 Keskmine väärtus 537,5 529,8 Standardhälve 9,4 1,5 15 919,7 898,4 15 913,8 876,1 Keskmine väärtus 916,8 887,3 Standardhälve 4,2 15,8 30 1754,2 1695,8 30 1801,2 1731,7 Keskmine väärtus 1777,7 1713,8 Standardhälve 33,2 25,4 0 5 10 15 20 25 30 35 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 170.6 537.5 916.8 1777.7 f(x) = 60.13 x − 21.27 R² = 1 Kontsentratsioon [μg/mL]μg/mL]g/mL] P ii g i  p in d a la Graafik 1. Teobromiini kalibratsioonigraafik. 3


0 5 10 15 20 25 30 35 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 163 529.8 887.3 1713.8 f(x) = 57.89 x − 15.86 R² = 1 Kontsentratsioon [μg/mL]μg/mL]g/mL] P ii g i  p in d a la Graafik 2. Kofeiini kalibratsioonigraafik. Kalibratsioonivõrrandid: teobromiiin y = 60.133x - 21.272 kofeiin y = 57.885x - 15.863 3.2.  Kromatograafiliste parameetrite arvutamine (T – teobromiin, K-kofeiin) (arvutatud kasutades analüüsi tulemusi, mis olid saadud kontsentratsiooniga 10 
μg/mL (ruumala 1mL)g/mL) Algandmed: Surnud aeg, t0 = 2,332 min Retensiooniaeg, tR, min Piigi laius, min Teobromiin 2,67 0,105 Kofeiin 4,762 0,1496 Pii
k Mahtuvustegu
r Efektiivsus Lahutuvus Selektiivsus T 0,14 10346 16,4 7,2 K 1,04 16212 4


 Arvutused teobromiini näitel:
Mahtuvustegur: k’ = (tR – t0) / t0 = (2,67 – 2,332) / 2,332 = 0,14 Efektiivsus: W = 0,105
N = 16 ∙ (tR / W)2 = 16 ∙ (2,67 / 0,105)2 = 10346 Lahutuvus: R =  ∆ t R ( W 1 +W 2)/ 2 = 4,762−2,67 ( 0,105+0,1496)/2 =¿  16,4 Selektiivsus: α = (tR2 – t0) / (tR1 – t0) = (4,762 – 2,332) / (2,67 – 2,332) = 7,2 3.3. Kofeiini ja teobromiini määramine reaalses proovis Märkus   2:   Teobromiini   sisaldus   proovis   on   liiga   madal   ning   kalibratsioonialast
väljas, seega ei ole võimalik seda antud standardidega kalibreerides määrata.  Proov Kaalutis , g Lahjendu s Kofeiini pindala Teobromiin i pindala Kofeiini sisaldus proovis mg/g Teobromiin i sisaldus proovis mg/g Tee 2 15x 1334,9 vt märkus 2 26,3 <0,003 vt märkus 2 15x 1302,9 25,6 Keskmine väärtus 1318,9 26 Sisalduse arvutamine: piigi pindala (y) = 1334,9
y = 57,885x – 15,863
  x = (y + 15,863) / 57,885 = (1334,9 + 15,863) / 57,885
x = 23,34 μg/mL kohta oli tehtud kolm paralleeli, millest kaks g/mL  (kofeiini kontsentratsioon 15x lahjenduses) 23,34 μg/mL kohta oli tehtud kolm paralleeli, millest kaks g/mL   ∙ 15 = 350,1 μg/mL kohta oli tehtud kolm paralleeli, millest kaks g/mL  (kofeiini sisaldus 1mL-s algses lahuses) Algselt oli 150 mL lahust (teed)
 350,1 μg/mL kohta oli tehtud kolm paralleeli, millest kaks g/mL  ∙ 150 mL = 52515 μg/mL kohta oli tehtud kolm paralleeli, millest kaks g = 52,515 mg (kofeiini algses lahuses) Kaalutud oli 2 g teed
52,515 mg / 2 g = 26,3 [mg/g] 5


4 Kokkuvõte ja järeldused Töö tulemusena saadi kofeiini sisalduseks rohelises tees ca  26 mg/g. Teobromiini
sisaldus   proovis   oli   liiga   madal   (<   0,003   mg/g),   et   seda   saaks   antud
kontsentratsioonidega standardeid kasutades määrata.  6

Document Outline

• 1 Töö eesmärk
• 2 Töö käik
• 3 Tulemused
• 3.2. Kromatograafiliste parameetrite arvutamine (T – teobromiin, K-kofeiin)
• 4 Kokkuvõte ja järeldused