rekombinantneDNA molekul, mis on võimeline sisenema(näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA replikatsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 10 identset viiruse või plasmiidi DNA molekuli. Sama koefitsendiga paljundatakse ka rekombinantset DNAd. 4. Rekombinantsete kloonide eraldamine -Selektiivsöötmel kasvatatud kloonidest eraldatakse rekombinantne DNA. Esimesena näitasid pärilikkuse funktsionaalse ühiku ühest organismist teise ülekandmise võimalikkust Stanley Cohen, Herbert Boyer ja nende kaastöölised (Stanfordi ja California Ülikoolidest) 1972 -1973. aastal DNA kloonimine võimaldab: huvipakkuvate DNA fragmentide piiramatus koguses paljundamist geeniproduktide, enamasti valkude tootmist
Nime tuleb kirjutada plaadi äärde, selleks et edasi oleks võimalik eristada sinised ja valged kolooniad. (7) Transformeeritud rakkude külvamine Petri tassidele: Transformeeritud rakkude tuubi lisa 10 l IPTG ja 10 l X-gali lahust, sega korralikult, kuid ära tsentrifuugi! Nende substraatide lisamine on vajalik beta-galaktosidaasi ekspressiooniks, mis võimaldab identifitseerida bakteri kolooniad, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid). (8) Saadud segu (230 l) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka. Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega. (9) Paiguta saadud tassid ümberpööratult 37 oC inkubaatorisse. Kolooniate värvusreaktsioon (sinine/valge) ilmneb 12-20 h pärast. Seejärel eemalda tassid inkubaatorist (teeb juhendaja). Tassid paneme ümberpööratult ,selleks et kondensaat ei tilgu agari peale.
Tassid tarduvad ~15 min pärast. Iga üliõpilane saab ühe Petri tassi ja kirjutab oma nime plaadi äärde (sellele poolele, kus on agar). (7) Transformeeritud rakkude külvamine Petri tassidele: Transformeeritud rakkude tuubi lisa 10 l IPTG ja 10 l X-gali lahust, sega korralikult, kuid ära tsentrifuugi! Nende substraatide lisamine on vajalik beta-galaktosidaasi ekspressiooniks, mis võimaldab identifitseerida bakteri kolooniad, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid). (8) Saadud segu (230 l) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka. Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega. (9) Paiguta saadud tassid ümberpööratult 37 oC inkubaatorisse. Kolooniate värvusreaktsioon (sinine/valge) ilmneb 12-20 h pärast. Seejärel eemalda tassid inkubaatorist (teeb juhendaja). (10) Interpreteeri tulemused (ligeerimise efektiivsus, kolooniate arv, jne
DNA molekul, mis on võimeline sisenema (näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Selektiivne paljundamine. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 1012 identset viiruse või plasmiidi DNA molekuli. Sama koefitsendiga paljundatakse ka rekombinantset DNAd. 4.Rekombinantsete DNA kloonide eraldamine Selektiivsöötmel kasvatatud kloonidest eraldatakse rekombinantne DNA Esimesena näitasid pärilikkuse funktsionaalse ühiku ühest organismist teise ülekandmise võimalikkust Stanley Cohen, Herbert Boyer ja nende kaastöölised (Stanfordi ja California Ülikoolidest) 1972 -1973. aastal. DNA kloonimine võimaldab: 1. huvipakkuvate DNA fragmentide piiramatus koguses paljundamist 2. geeniproduktide, enamasti valkude tootmist 3
Teiseks võimaluseks on konjugatsioon. Bakterite vaheliste konjugatsiooni tulemusena võib plasmiid üle kanduda teisse rakusse. 11. Mis on fagemiid? Millised eelised on antud vektoritel? Fagemiid on plasmiid, mis sisaldab f1 filomentse faagi regiooni, mis sisaldab replikatsiooni alguspunkte. Fagemiid Plasmiid M13 1.Filamentse faagi 1.toodab palju 1. ringikujuline DNA ahel kujuna või plasmiidina; rekombinantset DNAd 2.laseb eraldada kloonitud DNA võib käituda nii 2.kasutatakse cDNA fragmendid üheahelalisel kujul (võimalik plasmiidina, kui ka kloonimiseks sekveneerida) faagina 3.Konjugatiivsed ja 3.ei tapa bakterirakku 2.stabiilne mitte, runway tüüp 4.F-spetsiifiline rekombinantne DNA 3.Üheahelaline DNA 4.Sobib suuremate fragmentide sisseviimiseks 12
füüsiliselt samasse üksusesse, jäävad kokku ka pärast meioosi. Nt ristati 2 eri tunnusega suhkruherneid, tulemused ei tulnud 9:3:3:1 vaid 23,3:1:1:6,8, sest õite värvust ja tolmuterade kuju määravad geenid olid aheldunud. 30. Geneetilise materjali rekombineerumine ristsiirde teel. Ristsiire ehk crossing over homoloogiliste kromosoomide kromatiidi osade vahetamine. Ristsiirdel homoloogiliste kromosoomide kromatiidide vahel moodustub 2 rekombinantset ja kaks algset kromosoomi. See võib toimuda ka mitu korda ja ka tütarkromatiidide vahel. Ristsiirde ajal 1 kromosoom koosneb kahest tütarkromatiidist. Toimub kahe homoloogilise kromosoomi kromatiidide vahel. Meioos II lõpuks on 4 kromatiidi eraldi rakkudes. 31. Kas kõrge rekombinatsioonisagedus viitab uuritavate geenide üksteisele lähestikku või eemal paiknemisele? Põhjendage.
kasutatakse kindlat kirjaviisi: 1) coupling heterozygote (R&L, r&l) dominantsed alleelid on tõmbefaasis. Omavahel aheldunud ja samalt vanemalt pärit. 2) repulsion heterozygote (R&l, r&L) dom alleelid on tõukefaasis. Dom alleel on aheldunud rets alleeliga. 30. Geneetilise materjali rekombineerumine ristsiirde teel. Ristsiirdel homoloogiliste kromosoomide kromatiidide vahel moodustub kaks rekombinantset ja kaks algset kromosoomi. RS ajal koosneb krom kahest tütarkromatiidist. RS toimub kahe homoloogilise kromosoomi kromatiidide vahel. Meioos II lõpuks satuvad 4 kromatiidi eraldi rakkudesse. 31. Kas kõrge rekombinatsioonisagedus viitab uuritavate geenide üksteisele lähestikku või eemal paiknemisele? Põhjendage. Viitab sellele, et geenid paiknevad üksteisest eemal. Rekombinatsioonisagedus näitab, et geenid pole aheldunud, vaid on toimunud ristsiire
viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Selektiivne paljundamine. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud (muundatud) rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 1012 identset viiruse või plasmiidi DNA molekuli. Sama koefitsendiga paljundatakse ka rekombinantset DNAd. 4.Rekombinantsete DNA kloonide eraldamine. Selektiivsöötmel kasvatatud kloonidest eraldatakse rekombinantne (milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA fragmendid) DNA. 41. Mis on cDNA? RNA matriitsilt in vitro (katseklaasis kunstlikult loodud ja kindlalt määratletud tingimustes) sünteesitud DNA-molekul. 42. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Luuakse mudelhiired, et nende peal katsetades leida ravimeid erinevatele haigustele,
Diploidne rakk läbib meioosi, mille tulemusena tekib 4 haploidset askospoori, mis jäävad kokku askusesse Iga askus sisaldab ühe konkreetse meioosi produkte! – suurepärane võimalus. Saccharomyces cerevisiae ristriisre uurimisel Ühe ristsiirde tagajärjel on askuses 2 spoori vanemtüüpi ja 2 rekombinantsed, sest ristsiirdel homoloogiliste kromosoomide kromatiidide vahel moodustub 2 rekombinantset ja kaks algset kromosoomi. Ühe rekombinatsioonisündmuse tulemusena sisaldub pagaripärmi askuses kaks rekombinantset ja kaks mitterekombinantset askospoori. Järelikult toimub ristsiire pärast seda, kui homoloogilised kromosoomid on duplitseerunud. Homoloogiliste kromosoomide tütarkromatiidide vahel võib toimuda mitu ristsiiret, kuigi ühes kindlas kohas osalevad korraga 2 kromatiidi. Ristsiirde toimumist ei tuvastata, kui see toimub geneetiliselt identsete tütarkromatiidide vahel
In vitro kasutatakse hüübimise pärssimiseks madalat temperatuur, antikoagulante - hepariini, Na-tsitraati, K-oksalaati, EDTA (viimased kolm seovad Ca-ioone). In vivo aspiriini, kumariini derivaate. Kehaomastest ainetest hepariin, antirombin III, proteiin C. /var/www/html/annaabicron/doc/14490998629056.doc 8 Hüübimise kiirendamiseks in vitro temperatuuri tõstmine, trombiini, koeekstrakte (sisaldavad koetromboplastiini). In vivo (hemofiilia) rekombinantset faktorit VIII. NÄRVI- JA LIHASFÜSIOLOOGIA Programm veterinaarmeditsiini üliõpilastele 1. Ainete transport läbi membraanide. 1.1. Plasmamembraani ehitus. Põhikomponendid on lipiidid, valgud, süsivesikud ja vesi (15-23%). Biomembraanide üldehitus on sarnane, kuid teatud erinevused on tingitud erifunktsioonidest – erinevus seisneb peamiste ehituskomponentide (fosfolipiidid, valgud jne) hulga ja vahekorra varieerumises.
ja ümarate tolmuteradega taimedega. Punane värvus ja piklikud tolmuterad osutusid dominantseteks tunnusteks. Kui ristati omavahel saadud hübriide, siis erinesid saadud teise järglaskonna taimede fenotüübiline jagunemine oodatavast 9:3:3:1, tegelik suhe oli hoopis 23,3:1:1:6,8. Tulemus tulenes sellest, et vastavad geenid pärandusid aheldunult. Samas sisaldasid esimese põlvkonnas moodustunud gameedid osadel juhtudel ka rekombinantset DNAd. 30. Geneetilise materjali rekombineerumine ristsiirde teel. · Ristsiire toimub meioosi esimeses profaasis, kui homoloogilised kromosoomid omavahel paarduvad. Protsessis osaleb homoloogiliste kromosoomide neljast kromatiidist koosnev tetraad, kuid konkreetne ristsiire toimub vaid kahe homoloogilise kromatiidi vahel. Kaks ülejäänud kromatiidi ei rekombineeru. Meioosi II lõpuks satub iga kromatiid erinevatesse tütarrakkudesse. 31
ebaproportsionaalselt palju punaste ja piklike tolmuteradega taimi (583) ning valgete õitega ja ümarate tolmuteradega taimi (170). Tegelik suhe oli seega 23,3:1:1:6,8. Kõrvalekalle tulenes sellest, et õite värvust ning tolmuterade kuju määravad geenid olid aheldunud. Kuna F2 järglaskonnas oli ka punaste õitega ja ümarate tolmuteradega ning valgete õitega ja piklike tolmuteradega taimi, sisaldasid F1 põlvkonnas moodustunud gameedid osadel juhtudel rekombinantset DNA-d, kus ühe geeni alleelid olid teise geeni alleelide suhtes vahetunud. 29 Rekombinatsiooni sagedus võimaldab mõõta geenide aheldatuse määra Geenid, mis paiknevad üksteise suhtes lähestikku, on tugevamalt aheldunud ning rekombineeruvad harvemini. Seega võimaldab geenidevahelise rekombinatsiooni sagedus hinnata nendevahelist aheldatust
kahest genotüübist, mis vastab ühele või teisele ristatud pärivuspuhastest vanemvormidest (tõugudest, sortidest, liinidest). Vastandatakse rekombinantidele . Mittevanemtüüp - iga indiviid või rakk, mis on tekkinud vanemtüüpi genotüüpide (fenotüüpide) ümberkombineerumise tagajärjel. Tetratüüp - spooride korraldatus askomütseetides. Üks tetrade kolmast tüübist on voimalik kui 2 geeni jagunevad risti. Tetrad sisaldavad 2 vanemate ja 2 rekombinantset tuuma, üks igast vanemtüübist ja üks igast mittevanemtüübist näitamas üht crossingoverit kahe aheldunud lookuse vahel. Naiteks AB, aB, Ab, and ab. 73. Krossingoveri eripära Neurospore crassa-l. Spooride järjestus askustes. Esimese meiootilise jagunemise produktid jäävad eluvõimelistena ja ei segune. See toimub tänu sellele, et kahe meiootiliste jagunemiste kääviniidid on ühtemoodi orienteeritud. Geneetiliste
retroviirused, näiteks HIV), võib geneetiline informatsioon liikuda ka RNA-lt DNA-le. Informatsiooni liikumine RNA-lt valgule on aga alati ühesuunaline. Rekombinantse DNA tehnoloogia Kaasajal kasutatakse geenide molekulaarseks analüüsiks rekombinantse DNA tehnoloogiat. Tehnoloogia põhineb DNA fragmentide isoleerimisel genoomist ning viimisel väikestesse, rakus iseseisvalt replitseeruvatesse DNA molekulidesse kloneerimisvektoritesse, mis võimaldavad rekombinantset DNA- d paljundada, saada selle paljundamisel koopiaid e. kloone. Vastavat protseduuri nimetatakse geenide kloneerimiseks. Kloneerimisel on mitmeid rakendusi: 1) DNA primaarjärjestuse määramine e. sekveneerimine 2) geeni(de) avaldumise regulatsiooni uurimine 3) geenide poolt kodeeritud valkude funktsioonide uurimine 4) geenitehnoloogia 1
retroviirused, näiteks HIV), võib geneetiline informatsioon liikuda ka RNA-lt DNA-le. Informatsiooni liikumine RNA-lt valgule on aga alati ühesuunaline. Rekombinantse DNA tehnoloogia Kaasajal kasutatakse geenide molekulaarseks analüüsiks rekombinantse DNA tehnoloogiat. Tehnoloogia põhineb DNA fragmentide isoleerimisel genoomist ning viimisel väikestesse, rakus iseseisvalt replitseeruvatesse DNA molekulidesse kloneerimisvektoritesse, mis võimaldavad rekombinantset DNA- d paljundada, saada selle paljundamisel koopiaid e. kloone. Vastavat protseduuri nimetatakse geenide kloneerimiseks. Kloneerimisel on mitmeid rakendusi: 1) DNA primaarjärjestuse määramine e. sekveneerimine 2) geeni(de) avaldumise regulatsiooni uurimine 3) geenide poolt kodeeritud valkude funktsioonide uurimine 4) geenitehnoloogia Paljude kloneerimisvektorite konstrueerimisel on kasutatud bakteriofaagide genoomi ja bakterite
ebaproportsionaalselt palju punaste ja piklike tolmuteradega taimi (583) ning valgete õitega ja ümarate tolmuteradega taimi (170). Tegelik suhe oli seega 23,3:1:1:6,8. Kõrvalekalle tulenes sellest, et õite värvust ning tolmuterade kuju määravad geenid olid aheldunud. Kuna F2 järglaskonnas oli ka punaste õitega ja ümarate tolmuteradega ning valgete õitega ja piklike tolmuteradega taimi, sisaldasid F1 põlvkonnas moodustunud gameedid osadel juhtudel rekombinantset DNA-d, kus ühe geeni alleelid olid teise geeni alleelide suhtes vahetunud. 6.2. Kuidas mõõta geenide aheldatuse määra ? Geenid, mis paiknevad üksteise suhtes lähestikku, on tugevamalt aheldunud ning rekombineeruvad harvemini. Seega võimaldab geenidevahelise rekombinatsiooni sagedus hinnata nendevahelist aheldatust. Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks ristatakse uuritavate tunnuste suhtes aheldunud geenidega isendeid, näiteks eelpoolkirjeldatud heterosügootseid F1
annaabi.ee 
