järjestusalas ,,augud" (footprintid). Footprintinguga saab määrata ka järjestust, millele uuritav valk seob. 2) EMSA on kasulik meetod DNAd siduvate valkude kvantitatiivseks analüüsiks. Üldjuhul on DNA fragmentide elektroforeetiline mobiilsus langenud, kui nad on valguga kompleksis, mis põhjustab fragmendi geeli asukoha muutust (bänd (värv) jääb maha võrreldes vaba DNAga). Seda analüüsi saab kasutada tuvastamaks valgulüsaadist regulaatorvalgu olemasolu kasutades tuntud regulaatorelementi sisaldavat DNA fragmenti, mis on eelnevalt radioaktiivselt märgitud. Lane 1 is a negative control, and contains only DNA. Lane 2 contains protein as well as a DNA fragment that, based on its sequence, does not interact. Rida 3 sisaldab valku ja DNA fragmenti, mis reageerib. Saadud kompleks on suure, raskem ja aeglasem. Muster real 3 on sellisel juhul kui kogu DNA oleks seotud ja elektroforeesi ajal ei toimunud
toimumiseks on vajalik translatsiooni terminatsioon enneaegsel stop-koodonil. 7. Regulaatorvalkude olulisemad alaklassid pro- ja eukarüootsel geeniregulatsioonil? Heeliks-pööre-heeliks motiiviga valgud. Homeodomääni valgud. Tsinksõrme sisaldavad valgud. Aluselised leutsiini-tõmblukku sisaldavad valgud. Aluselised heeliks-ling-heeliks valgud. POU-domääni valgud. Steroidhormoonide retseptorid 8. Iseloomusta heelixlingheelix regulaatorvalgu ehitust joonisena ja kirjelda funktsiooni? Kaks -heeliksit [polüpeptiidahela spiraalne sekundaarne struktuur], mis on ühendatud pikema, painduva aminohappelise linguga. Selline ehitus võimaldab heeliksite vaba ruumilist liikumist. Aluselised valgud seondumine DNA-ga toimub 15 aminohappe pikkuse aluselise piirkonna kaudu. Homodimeersed (seondunud on 2 ühesugust valgumolekuli) helix-ling-helix
Struktuurkomponendid - Promootori 2 osa - Promootor ja operaator kattuvad osaliselt - Operaatorijärgsed piirkonnad - Terminaatorjärjestused 55.Positiivne geneetiline kontroll 1) Promootori tasemel (ees) - Süsteemi algolek suletud - Regulaatorgeen aktivaatori 2) Pidrudatud süsteemid - Suletud süsteemis – regulaatorgeeni produkt on aktiivne regulaator, seondub regulaatorvalgu seondumise saidiga promootori ees, aktiveerib struktuurgeenid - Aktiivne aktivaator + korepressor – represseerib struktuurgeenid 3) Indutseeritud süsteemid - Sünteesitakse inaktivaatne aktivaator, ei seondu regulaatorvalgu seondumise saidiga promootori ees, ei aktiveeri struktuurgeene - Inaktiivne aktivaator + induktor – aktiveerib struktuurgeenid 56.Negatiivne geneetiline kontroll 1) Operaatori tasemel (promootori järel)
Faktor vabaneb pärast esimese 10 nukleotiidi sünteesi. 9. Defineeri prokarüootne operon. Kirjelda geeni aktivatsiooni protsessi pro-karüoodis trp või lac operoni näitel. Funktsioneeriv üksus, nukleotiidne järjestus sisaldab: *operaator DNA lõik, mis aktiv/inhib strukt. geene; sinna seostuvad aktivaator/repressor *promootor RNA-pol seondumiskoht + initsiatsioon *struktuurne geen sellelt toodetakse mRNA *regulaatorgeen st. repressor, mis kodeerib regulaatorvalgu, mis seondudes operaatoriga takistab transkriptsiooni. Operon kobar järjestikuseid geene, mida transkribeeritake ühelt promootorilt ning mille transkript omab paljude erinevate valkude transleerimiseks vajalikku järjestust. lac-operon valke toodetakse vaid laktoosi olemasolul Laktoosi operon sisaldab promootor, operaator, 3 struktuurset geeni : lacZ, lacY, lacA (esimesed 2 vajalikud). Lac operon on indutseeritav, sest geenid avalduvad vaid laktoosi
8. Operon, struktuur operon (ingl. Operon)- Grupp geene, mis moodustavad ühtse regulatoorse või kontrollüksuse. Üksus koosneb operaatorist, promootorist ja struktuurgeenidest. Omased prokarüootidele. 9. Positiivne geneetiline regulatsioon 1. Promootori tasemel (ees) Süsteemi algolek suletud Regulaatorgeen aktivaatori 2. Pidurdatud süsteemid Suletud süsteemis = regulaatorgeeni produkt on aktiivne aktivaator, seondub regulaatorvalgu seondumise saidiga promootori ees, aktiveerib struktuurgeenid Aktiivne aktivaator + korepressor (efektormolekul) = represseerib struktuurgeenid 3. Indutseeritud süsteemid Sünteesitakse inaktiivne aktivaator, ei seondu regulaatorvalgu seondumise saidiga promootori ees, ei aktiveeri struktuurgeene Inaktiivne aktivaator + induktor (efektormolekul) = aktiveerib struktuurgeenid 10
histoonide atsetülaasidega ja põhjustades kromatiini dekondensatsiooni) (7-48 lk 405, 7-58 lk 411, Abeles) Regulaatorvalke, mis ei seostu DNA-ga vaid DNA-ga seotud valkudega nim koaktivaatoriteks/korepressoriteks. Rakud peavad olema võimelised sisse/välja lülitama individuaalseid geene, aga nad peavad olema võimelised koordineerima ka suurte geenide plokkide sisse ja väljalülitust nagu see on vajalik erinevate organite ja kudede moodustumisel arengus. Ühe nn kriitilise regulaatorvalgu ekspresseerumine, mille jaoks on cis elemendid erinevates koos funktsioneerivates geenides, põhjustab kogu geenide ploki ekspresseerumise ja ühe rakutüübi muutumise teiseks. Seega igal geenil pole mitte ainult hulk cis elemente, vaid üks trans faktor võib kontrollida erinevaid geene. Uue regulaatorvalgu lisandumise effekt rakus sõltub sellest, millised regulaatorvalgud juba on olemas st raku eelnevast arengust. Arenguliselt reguleeritud geenide (näit
positiivne ja negatiivne geneetiline kontroll. Mõlema korral kasutatakse geenide sisse- ja väljalülitamist vajaliku kontrolli saavutamiseks. Mõlema kontrollmehhanismi juures esinevad indutseeritud ja pidurdatud süsteemid. Positiivse kontrolli puhul on süsteem algolekus suletud. Regulaatorgeeni produktiks on aktivaator, mida on vaja struktuurgeenide sisselülitamiseks. Positiivse geneetilise kontrolli puhul regulatsioon toimub promootori tasemel, aktivaator seondub promootori ees oleva regulaatorvalgu seondumissaidiga. Negatiivse kontrolli puhul on süsteem algolekus suletud. Regulaatorgeeni produktiks on repressor, mis on vajalik geenide väljalülitamiseks. Negatiivse geneetilise kontrolli puhul on regulatsioon operaatori tasemel ja repressor seondub promootori järel olevasse regulaatorgeeni seondumissaiti. 19. Mittekodeerivad RNA-d geeniekspressiooni regulatsioonis * RNA interferents (RNAi) eukarüootides RNA interferents e. RNA häiring e. RNAi eukarüootides
uurimine on praegu veel algusjärgus. Kuid siiski on võimalik püstitada mõningaid üldisi printsiipe selliste geenide evolutsiooni järelmite kohta. Esimese sedatüüpi analüüsi on teinud ameerika molekulaargeneetik, üks molekulaarkella printsiibi rajajaid E. Zuckerkandl (1976). Tema väitel avalduvad regulaatorgeenide mis tahes mutatsioonid esmaste efektide tasemel kahesuunaliste kvantitatiivsete muutuste näol, kuna nad seisnevad regulaatorvalgu ja retseptormolekuli (valgu või DNA-lõigu) sugulusastme nihkes. Kuid sellised molekulaarsete interaktsioonide kvantitatiivsed muutused võivad põhjustada kardinaalseid kvalitatiivseid ümberkorraldusi raku või organismi tasemel. Veel enam, mingi ühe regulatsioonisüsteemi eri geenide mutatsioonid võivad põhjustada samasuunalisi muutusi (olgu kvantitiivseid või kvalitatiivseid). Kui geneetiliselt lähedaste liikide rühm allub samasuunalisele valikurõhule, siis
kulukas. Lisaks ei mahu kõik süsteemid bakteri membraani ning väheneb bakterite kohasus, sest metabolism on koormatud vähemenergeetiliste toitainete lagundamisega. Rakusiseste ja väliste signaalide abil reguleeritakse ebavajalikud transportsüsteemid alla ning vajalikud üles. Rakuväliseid signaale tunnetab bakter peamiselt kahekomponentsete signaalsüsteemide abil. Millest üks on sukeldunud membraani ning seondub signaalmolekuliga. Sellele järgneb tsütoplasmas oleva regulaatorvalgu aktiveerimine, mis reguleerib geenide ekspressiooni. Umbes 60 kahekomponentset signaalsüsteemi on teada E. coli rakus, mis tunnetavad sealhulgas rakuvälist fosforit, nitraati ja süsinikallikat. Lisaks kahekomponentsetele signaalsüsteemidele on paljudel heterotroofsetel bakteritel nagu E. coli olemas rakusisesed süsinikallika sensorid, mis tunnetavad rakus süsinikallika kontsentratsiooni ning vastavalt signaalile reguleerivad geenide transkriptsiooni
Näiteks kemotaksise puhul on sensorvalguks histidiini kinaas CheA, mis pärast autofosforüleerumist interakteerub regulaatorvalkudega CheB ja CheY ja fosforüleerib need. Fosforüülrühma ülekande ja kinaasse aktiivsusega domäänid histidiini kinaasil ning response regulaatori vastuvõttev (receiver) domään on konserveerunud sama perekonna valkude piires. Varieeruvad sensorvalgu signaali äratundev N- terminaalne domeen ja regulaatorvalgu efektor-domeen. Signaali tunnetavad retseptorid võivad asuda nii transmembraanses kui ka periplasmaatilises või tsütoplasmaatilises sensor-domäänis. Sama sensor võib anda signaali mitmele erinevale regulaatorile ja sama regulaator võib saada signaale erinevatelt sensoritelt. Kirjeldatud on ka ühekomponendilisi signaali ülekandesüsteeme. Näiteks Vibrio cholerae ToxR valk on transmembraanne. ToxR tunneb ära raku
aktivaatorina. Näiteks kemotaksise puhul on sensorvalguks histidiini kinaas CheA, mis pärast autofosforüleerumist interakteerub regulaatorvalkudega CheB ja CheY ja fosforüleerib need. Fosforüülrühma ülekande ja kinaasse aktiivsusega domäänid histidiini kinaasil ning response regulaatori vastuvõttev (receiver) domään on konserveerunud sama perekonna valkude piires. Varieeruvad sensorvalgu signaali äratundev N-terminaalne domeen ja regulaatorvalgu efektor-domeen. Mida detailsemalt signaali ülekandesüsteeme uuritakse, seda kirjumaks pilt muutub. Signaali tunnetavad retseptorid võivad asuda nii transmembraanses kui ka periplasmaatilises või tsütoplasmaatilises sensor-domäänis. Sama sensor võib anda signaali mitmele erinevale regulaatorile ja sama regulaator võib saada signaale erinevatelt sensoritelt. Kirjeldatud on ka ühekomponendilisi signaali ülekandesüsteeme. Näiteks Vibrio cholerae ToxR valk on transmembraanne
annaabi.ee 
