1. 4 eri nukleotiidi (A, G, C, U/T) 2. Võimalik kood:: · 1 4 AAs <20 · 2 4 x 4 = 16 AAs <20 · 3 4 x 4 x 4 = 64 AAs >>20 3. Kolm nukleotiidi annavad 64 kombinatsiooni 20 a/h. Järelikult kood degenereeruv: rohkem kui üks koodon määrab ühte a/h. Tõestused, et kood on triplet: 1. 1960s: Francis Crick et al. 2. Uuris raaminihke mutatsioone faagil T4 (& E. coli), indutseeriti proflaviiniga. 3. Proflaviin lisab või võtab ära aluspaare 4. Mutantide identifitseerimine: 1. Kasv E. coli B: r+(metsik) tihe kasv rII (mutant) harv 1. Kasv E. coli K12(): r+ (metsik) kasv rII (mutant) kasv puudub 1. Raaminihke mutatsioon põhjustab erinevusi a/h ahelas
Ei lase virioni sisse RNA-d degradeeruvaid ensüüme. L-A viiruse genoomi organisatsioon L-A viiruse genoom on dsRNA (mõlemal ahelal puuduvad cap ja poly(A) järjestused) mille positiivses ahelas asub kaks teineteisega kattuvat lugemisraami. Need kodeerivad vastavlt: o Peamist kattevalku (tavaliselt nimetatakse seda gag- valguks, 76 kDa o Polümeraasi (pol. 100 kDa domeen). See ekspresseerub ribosomaalse -1 raaminihke abil fusion valgu gag-pol kujul (pol moodustab fusion-valgu C-terninaalse domeeni). L-A viiruse pol kujutab endast tüüpilist RdRp-d, milles asuvad lisaks polümeraasi konsensusele, ka kolm ssRNA-d seondavad domeeni. L-A viiruse satelliit RNA organisatsioon Iga M-saidi genoom kodeerib oma positiivse ahela 5’- poolses otsas pre- protoksiin valku. Satelliitide 3’- otsa poolne järjestus valke ei kodeeri kuid sisaldab
kaugus oluline parameeter, mis peab kõigil tRNA'del olema sama (70 Å). tRNA funktsiooni seisukohalt on tähtsaim osa antikoodon (nukleotiidid 34-36). Antikoodoni kolm nukleotiidi paarduvad mRNA kolme nukleotiidiga (koodoniga), mis on geneetilise translatsiooni (nukleiinhappe järjestuse valgu järjestuseks tõlkimise) struktuurseks aluseks. Seepärast on antikoodoni geomeetria oluline koodon-antikoodon interaktsiooni toimumisel. Antikoodon aasas on alati (v.a. raaminihke suppressorid, vt. allpool) 7 nukleotiidi, milles antikoodoni moodustavad 3 keskmist nukleotiidi. Antikoodoni ees paikneb konserveerunud U33 nukleotiid, mille järel teeb nukleiinhappe ahel järsu pöörde (vt. joonis 7.7). Antikoodoni kõik kolm nukleotiidi paiknevad RNA ahela ühel küljel sarnases konformatsioonis nagu esineb RNA kaheahelalises A vormis. Atikoodon on sobivas struktuuris koodoniga paardumiseks. Antikoodon aasa struktuur on oluline ka lugemisraami hoidmisel, kuna U33 on
Punktmutatsioonid – muutused geeni tasemel. Transitsioonid – puriin asendub puriiniga (A ↔ G) või pürimidiin pürimidiiniga (C ↔ T) Transversioonid – puriin asendub pürimidiiniga või vastupidi (nt. T ↔ G ja A ↔ C asendused) 1. Sünonüümsed mutatsioonid – koodon määrab sama aminohapet 2. Missens mutatsioonid – muutub koodoni tähendus, määrab teist aminohapet 3. Nonsens mutatsioonid – viivad stoppkoodoni tekkele 4. Raaminihke mutatsioonid – muutub lugemisraam ja seetõttu ka valgu aminohappeline järjestus Enamus kahjulikke mutatsioone populatsioonis on retsessiivsed. Dominantseid kahjulikke mutatsioone sisaldavad alleelid kõrvaldatakse loodusliku valiku teel kiiremini. 75. Ames´i test kemikaalide mutageensuse uurimiseks. 39 Bruce Ames ja kolleegid töötasid välja kiire, odava ja väga tundliku meetodi kemikaalide mutageensuse testimiseks
kromosoomi piires kui ka kromosoomide vahel. DNA vigade tüübid ja nende parandamine Vigade tüübid: replikatsioonivead, kühmud liigsetest või puuduvatest jääkidest, UV-indutseeritud vead. Valesti paardunud lõigud ja kahjustada saanud lõigud asendatakse uutega. DNA mutatsioonid Spontaansed või indutseeritud päritavad muutused kromosoomi nukleotiidide järjestuses. Jagunevad asendimutatsioonideks, punktmutatsioonideks ning raaminihke mutatsioonideks. Mutageenideks võivad olla radiatsioon, UV kiirgus, keemilised mutageenid (näiteks lämmastikushape). DNA, RNA ja valgud Transkriptsioon prokarüootidel Prokarüootidel on ainult 1 RNA polümeraas. Transkriptsioon jaguneb nelja staadiumisse: · RNA polümeraas seondub promootorsaiti · Initseeritakse polümerisatsioon · RNA ahel pikeneb tänu fosfodiestersidemetele, polümeraasile järgneb güraas, et leevendada DNA lahtikeerdumisest tekkinud pingeid
Mõju valgu AH järjestusele: · Sünonüümsed mutatsioonid koodon määrab sama aminohapet · Missens mutatsioonid muutub koodoni tähendus, määrab teist AH-d · Nonsens mutatsioonid viivad stoppkoodoni tekkele Transitsioonide ja transversioonide tõttu võivad muutuda transleeritavad aminohapped ja seetõttu võib muutuda valgu nukleotiidne järjestus ja seetõttu ka valgu algne funktsioon Raaminihke mutatsioonid muutub lugemisraam ja seetõttu ka valgu aminohappeline järjestus, tekib hoopis teine polüpeptiid. 75. Ames´i test kemikaalide mutageensuse uurimiseks. Meetod põhineb bakterite histidiini suhtes auksotroofsete mutantide reverteerumissageduste mõõtmisel tingimustes, kus bakterite kasvukeskkonda on lisatud uuritavaid kemikaale. Mida mutageensem on kemikaal, seda suuremal hulgal
funktsiooni? Punktmutats muutused geeni tasemel. Asendusmutatsioonid aluspaaride asendus DNA järjestuses. Transitsioonid puriin asendub puriiniga (A G) või pürimidiin pürimidiiniga (C T). Transversioonid puriin asendub pürimidiiniga või vastupidi (T G ja A C asendused). Sünonüümsed mut koodon määrab sama aminohapet; missens mut muutub koodoni tähendus, määrab teist aminohapet; nonsens mut viivad stoppkoodoni tekkele; raaminihke mut muutub lugemisraam ja seetõttu ka valgu aminohappeline järjestus. 74. Ames´i test kemikaalide mutageensuse uurimiseks. Meetod põhineb bakterite histidiini suhtes auksotroofsete mutantide reverteerumissageduste mõõtmisel tingimustes, kus bakterite kasvukeskkonda on lisatud uuritavaid kemikaale. Mida mutageensem on kemikaal, seda suuremal hulgal tekib bakteripopulatsiooni revertante (bakt.rakke, mis on võimelised kolooniaid
Positsioonides 428 432 asuvates koodonites sisaldub 6 järjestikust adeniini ning seejärel raamis 1 järjestus UGA, mis võib toimida stop koodonina. Gamma subühik on 431 aminohappe pikkune. See valk on järjestuselt identne tau subühiku N-terminaalse järjestusega, kuid tema translatsioon on termineerunud varem teises lugemisraamis asuva stop koodoni poolt. - 1 raaminihe tekib A-järjestustel kõrge sagedusega. Seetõttu sünteesitakse gamma ja tau subühikuid bakterirakus suhtes 1:4. Raaminihke toimumist soodustab mRNA-s UGA koodonile järgnev juuksenõelastruktuur. Polüpeptiidide sünteesi terminatsioonil osaleva faktori RF-2 (release factor-2) süntees saab toimuda ainult tänu raaminihkele. Kui RF-2 kogus on rakus madal, on seda valku kodeeriva mRNA algusosas sisalduv stop koodon UGA translatsiooni terminatsiooniks ebapiisav. Sel juhul ribosoom küll peatub, kuid nihkub 3 U kohal +1 lugemisraami transleerimisele. Ainult nii sünteesitakse funktsionaalne valk. Programmeeritud
Mutatsioonide olemus: mutatsioonide avaldumine; spontaansed ja indutseeritud mutatsioonid; mutatsioonid tekivad juhuslikult; mutatsioonide reverteerumine. Mutatsioonide fenotüübiline efekt: dominantsed, retsessiivsed ja neutraalsed mutatsioonid; valgu omadusi ja metabolismiraja ensüümide aktiivsust mõjutavad mutatsioonid; letaalsete mutatsioonide uurimine. Mutatsioonitekke molekulaarsed mehhanismid: transitsioonid ja transversioonid; raaminihke mutatsioonid; keemiline mutagenees; kiirgusmutagenees; transponeeruvate elementide poolt põhjustatud mutatsioonid. Ames'i test kemikaalide mutageensuse uurimiseks. DNA reparatsioonimehhanismid: fotoreaktivatsioon; väljalõike reparatsioon (lämmastikaluste ja nukleotiidide väljalõikamine); DNA "mismatch" reparatsioon; SOS vastus ja rekombinatsiooniline reparatsioon. DNA rekombinatsioonimehhanismid. Geeni konversioon. 15. Geeni definitsioon
· Mõju polüpeptiidi funktsioonile Sünonüümsed mutatsioonid funktsioon ei muutu, sest muteerunud koodon määrab sama AH, mis algnegi koodon Missens mutatsioonid koodoni mutatsiooni tulemusena muutub koodoni tähendus see määrab teist AH't; muutub polüpeptiidi AH'line järjestus Nonsens mutatsioonid koodon muteerub stoppkoodoniks; polüpeptiidi ahela süntees katkeb ootamatult Raaminihke mutatsioon 75. Ames´i test kemikaalide mutageensuse uurimiseks. · Reverteerumine kui edasiviiv mutatsioon muudab algset DNA järjestust ning tekib sekundaarne mutatsioon, mille tulemusena taastub algne fenotüüp. · Amesi test: Meetod põhineb bakterite histidiini suhtes auksotroofsete mutantide reverteerumissageduste mõõtmisel tingimustes, kus bakterite kasvukeskkonda on lisatud uuritavaid kemikaale
Kui RF II-te on rakus vähe, siis toimub +1 raaminihe ja sünteesitakse RF II-te juurde. Enne seda on SD järjestus, et ribosoom oleks veits aeglasem. HIVis kapsiidi ja polümeraasi valgud kattuvad, aga kapsiidi on vaja umbes 100 korda rohkem. Transkribeeritakse üks mRNA. Enamus ribosoome transleerib kapsiidivalgu. Aga mõni ribosoom nihkub ühe nukleotiidi võrra tagasi (-1 raaminihe) ja terminatsioonikoodonit enam pole ja sünteesitakse liitvalk, mis hiljem üksteisest lahti lõigatakse. Raaminihke järel on pseudosõlme struktuur, kus ribosoom ei suuda läbi sõita, ja tänu sellele toimubki nihkumine. Pseudosõlm on see, kui juuksenõela paardumata osa paardub mingi edasise ahela osaga. Valkude väljumine ribosoomist. Kasvava peptiidi tunnel Geeniekspressiooni regulatsioon tunnelis (SecM, TnaC)
Asendusmutatsioone on kahte tüüpi: 1) Transitsioonid puriin-nukleotiid asendub puriin-nukleotiidiga ja pürimidiin-nukleotiid pürimidiin- nukleotiidiga (näiteks tsütosiin-nukleotiid tümiin-nukleotiidiga); 2) Transversioonid puriin-nukleotiid asendub pürimidiin-nukleotiidiga ja vastupidi (näit. adeniin- nukleotiid tsütosiin-nukleotiidiga). Ühe või kahe spontaansel lisandumisel DNA ahelasse või deleteerumisel DNA-st on tegemist raaminihke mutatsioonidega. Juhul, kui selline mutatsioon tekib valku kodeerivas geenis, nihkub nukleotiidse järjestuse lugemisraam. Näiteks ühenukleotiidse deletsiooni tõttu loetakse nukleotiidide tripleteid alates mutatsiooni kohast ühe nukleotiidi võrra nihkes ja selle tulemusena sünteesitakse translatsioonil hoopis teistsuguse aminohappelise järjestusega polüpeptiid, mis on kaotanud oma algse funktsiooni
pääseda, mis on normaalsest lühem (ja kahjulik). Supressor tRNA ja translatsiooni täpsus Valgu geenides toimuvad mutatsioonid võivad tekitada lugemisraamis stoppkoodoneid, mis põhjustavad valgu lühenemist ja funktsiooni kadu. Neid kahjulikke mutatsioone kõrvaldab surpressor tRNA. Surpressorid jagatakse: nonsens surpressorid – transleerivad stoppkoodoneid misens surpressorid – kui AH kodeerivaid koodoneid teise AH-na read-through translation – väga madal valgu ekspressioon raaminihke surpressorid – muuta valgusünteesi lugemisraami supressor tRNA-d – võimelised ära tundma stoppkoodoneid, suunavad stoppkoodonist sõltuvalt peptiidahelasse AH lülitumist. Eriti sagedased on mikroorganismides. Surub maha mutatsiooni. kuidas saab alguse surpressor tRNA? leiavad aset mutatsioonid tRNA antikoodonis, võib viia stoppkoodonile komplementaarse antikoodoni tekke – „viga parandab vea“ - geenis tekib viga, selle vea parandab tRNA-s toimuv supressor tRNA
Tekkinud N-alus annab vale paardumise (8-oxoG paardub adeniiniga). Ka selle muutunud struktuuriga N-aluse kõrvaldamiseks DNA ahelast on olemas oma spetsiifiline reparatsiooni süsteem. Siia kuuluvad kolm geeni mutM, mutT ja mutY. mutM N-glükosülaas + AP- endonukleaas, kõrvaldab valesti lülitunud A jäägi asendades selle Cga. mutY N-glükosülaas, mis spetsiifiliselt püüab kõrvaldada 8-oxoG=A paarist sinna valesti lülitunud A mutT fosfataas; 8-oxoGTP8-oxoGMP 2.3. Raaminihke mutatsioonid. Põhjuseks on ühe N-aluste paari kadumine või lisandumine. See võib toimuda nii spontaanselt kui ka mõnede mutageenide toimel. Selliste ühendite hulka kuuluvad 9-aminoakridiin, proflaviin, EtBr jt. Need nn. interkaleeruvadühendid paigutuvad ahelas kahe kõrvutioleva nukleotiidi vahele ja põhjustavad ahelate libisemist teineteise suhtes. Seda juhtub kõige sagedamini DNA piirkondades kus esinevad AT või GC kordused. 2.4. Deletsioon mutatsioonid
annaabi.ee 
