Genoomne DNA kogum kõik geenid, geenipank. Saab identsifitseerida. Genoomse kogumi loomiseks, kasutatakse genoomse DNA lõikamist restriktaasiga ja selle ligeerimine vektorisse: bakteriofaagid, kosmiidid, BAC ja YAC (Võivad esineda probleemid: geeni lõikamine keskel; geen on suurem, kui vektor võib vastu võtta. Kasutatakse randoomset lõikamist; ~20kb) Esineb mitu varianti cDNA sünteesimiseks: 1. cDNA sünteesitakse mRNA järgi, mille otsas on Polü-A-saba, mille praimeriks on polü-T oligonukleatiidne järjestus. Süntees toimub 5 3 suunas. Protsessi viib läbi revertaas dNTP olemasolul. Aluselises keskkonnas ühe ahelalise DNA ots keerab ja mängib rolli praimerina, sünteesitakse teist ahelat. Seda pööret lõikab ära S1 nukleaas. Lõpuks on kaheahelaline cDNA. 2. Kui esineb DNA:RNA kompleks, selle kompleksi tunneb ära ensüüm Rnase H, mis lõhustab RNA juppideks
sellele, et T4 kromosoom on rõngasmolekul. Tegelikult on T faagide kromosoom lineaarne. Millest sellised vastuolulisena näivad tulemused? T4 genoom on 168000 bp suurune. Viriooni pakitud DNA molekulid sisaldavad 3 - 5% ulatuses terminaalseid kordusi. Lineaarse DNA replikatsioonil jäävad molekulide otstesse üksikahelalised alad. DNA replikatsioon toimub ainult ühes suunas (5'3') ning seetõttu jääb praimerialune ala lineaarse DNA molekuli otstes pärast täis sünteesimata (praimeriks on RNA ja see kõrvaldatakse DNA molekulist DNA sünteesi järgselt). Selleks, et üksikahelalistele regioonidele sünteesitaks komplementaarsed ahelad, moodustuvad konkatemeerid (sama genoomi lineaarsed kordused). Konkatemeeride lahtilõikamine toimub faagi genoomi kapsiidi pakkimisel konstantse nukleiinhappe pikkuse tagant (ületab genoomi täismahu). Seetõttu on T4 DNA molekulid oma otsmistelt järjestustelt redundantsed (sisaldavad samu järjestusi, näit. abcdefg...
DNA polümeraas I lõikab praimerid välja. DNA ligaas täidab lüngad Okazaki fragmentide vahel. Replikatsiooni erinevused eukarüootides: eukarüootidel on mitu replikatsiooni saiti e replikaatorit. 3. Pöördtranskriptaas e RNA-juhitav DNA polümeraas retroviirustes, mis sünteesib RNA ahelale temaga komplementaarse DNA (cDNA) ahela. Pöördtranskriptaas on väga vigade aldis ensüüm, mille tõttu on viiruse genoom pidevas muutumises. Praimeriks on üks tRNA molekul, mille viirus haarab peremeesrakust. 4. DNA rekombinatsioon geneetilise info ümbergrupeerumine DNA molekuli piires või kahe DNA molekuli vahel. Homoloogiline (üldine) rekombinatsioon võib toimuda iga kahe DNA molekuli vahel, millel esineb järjestuste homoloogiat. Eukarüootides sagedane meioosis. Kõikides organismides roll replikatsioonis DNA vigade parandamisel. Asendispetsiifiline rekombinatsioon
tulemuseks on omavahel seotud glükoosijääkide polümeer. Ühe katalüütilise reaktsiooni tulemusena vabaneb UDP ja tekib ühe monomeeri jäägi võrra pikendatud polümeer. Hargnemist sünteesiv ensüüm katalüüsib lühikeste -1-4-glükosiidsidet sisaldavate glükoosi polümeeride ülekannet -1-6-glükosiidsideme külge. 9. Selgitage mis on glükogeniin ja kuidas see funktsioneerib. Glükogeeni süntaas ei ole võimeline glükogeeni sünteesima ilma juuretiseta e praimerita selleks praimeriks ongi glükogeniin. GLÜKOGEENI SÜNTEESI JA LAGUNDAMISE REGULATSIOON 1. Võrrelge glükogeeni sünteesi ja lagundamise kontrolli. Glükogeeni süntaas on põhiline kontrollreaktsioon glükogeeni sünteesil loomsetes rakkudes. 2. Kirjeldage, kuidas mõjutavad glükogeeni metabolismi lihastes ja maksas insuliin, glükagoon ja epinefriin. Insuliin stimuleerib glükogeeni sünteesi. Glükagoon ja epinefriin stimuleerivad lagundamist. 3
Semikonservatiivne 14N isotoopi sisaldav kerge DNA ahel ja 15N isotoopi sisaldav raske DNA ahel. Ühelt toimub replikatsioon pidevalt, teiselt katkendlikult. Leidis kinnitust. 50. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanism. Limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide ori regioonide olemasoluga. Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Praimeriks võib olla DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimerit on vaja, et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots, kuhu DNA polümeraas saab liita nukleotiide. 51. Erinevate DNA polümeraaside funktsioonid bakterites. Mis mehhanismidega on tagatud DNA replikatsiooni täpsus? Bakteril E.Coli on leitud 5 DNA polümeraasi(I,II,III,IV,V) I ja II osalevad DNA vigade parandusel III on põhiline DNA replikatsiooni ensüüm
tunnevad ära värvusreaktsiooni katalüüsivate ensüümidega märgistatud antikehad. Meetodi piiranguks on RNA molekulide piiratud arv (10 000) rakus sellepärast amplifitseeritaksegi RNA hulk PCRil (tekib miljardeid koopjaid). [Seda meetodit nimetatakse GenProbe meetodiks] 5. Mis limiteerib GenProbe meetodi (hübridiseerimine) puhul testi tundlikkuse? Nukleiinhapete hübridiseerimine: amplifitseerimise korral nimetatakse oligonukleotiidi praimeriks, hübridiseerimisel sondiks. Ahelad keeratakse lahti ja kui on sondile komplementaarne järjestus, siis renaturatsiooni puhul see lühike sond seondub eelistatult DNA ahelaga, sest alati lühike nukleotiidi järjestus seondub pika ahelaga paremini kui kaks pikka ahelat omavahel. INNO-LIPA hübriidimise meetod: amplifitseeritakse DNA, kasutades biotiin-märget (biotinoleeritud
,,rasked", kolmandal pooldumisel olid aga 1/4 ,,hübriidsed" ja 3/4 ,,kerged". 91. Replikatsiooni alguspunkt ja replikatsioonisilm. DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga. Nimetus ori tuleneb inglisekeelsest terminist "origin of replication". Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Erinevate DNA molekulide replikatsiooni puhul võib praimeriks olla kas DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas (ingl. k. primase). DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni toimel või spetsiifiliste initsiaatorvalkude seondumise tulemusena (DnaA oriC puhul, O oril puhul). Kuna DNA dupleksi avamine on lihtsam A- T rikastest regioonidest, on ori regioonid alati A-T rikkad. DNA ahelate lahtisulamise tulemusena
edasikanduvad muutused, deletsioonid eemaldavad osa kromosoomist, inversioonid on kromosoomiosa ümberpööramised, translokatsioonid on mittehomoloogsete kromosoomide osade vahetumised. Üks näide. 5. kromosoomi lühikese õla osaline deletsioon tekitab Cri cu chat sündroomi. REPLIKATSIOON 1. Eukarüootne replikatsioon. Mehanism, läbiviivad ensüümid. Okazaki fragmentide rolli DNA replikatsioonil. Helikaas avab DNA ahelad, Pol /primaasi kompleks sünteesib praimeriks RNA oligonukleotiidi, Pol võtab DNA sünteesimise üle, juhtivahel sünteesitakse Pol poolt ühe lõiguna, mahajääv ahel Pol poolt Okazaki fragmentidena. Telomeraas on pöördtranskriptaas, mis pikendab telomeeridel olevaid kordusjärjestusi niipalju, et replikatsiooni käigus kromosoom ei lüheneks. DNA replikatsiooni origin'id on kohad kromosoomidel, kust alustatakse DNA sünteesi. DNA replikatsiooni eukarüootides
Okazaki fragmendid seotakse üksteisega DNA ligaasi toimel. DNA polümeraas on võimeline ainult olemasolevat nukleiinhappe ahelat pikendama, vajades seetõttu sünteesi alustamiseks praimerit. DNA liiderahela sünteesil on vaba 3’OH otsaga praimerit vaja vaid üks kord, sünteesi alustamiseks. Iga viivisahela lõigu sünteesiks on vaja praimerit. Okazaki fragmentide sünteesi initsiatsiooniks on vaja valkkompleksi, mida nimetatakse praimosoomiks (DNA helikaas + primaas). DNA praimeriks on lühikesed RNA fragmendid, mille sünteesivad mahajääval ahelal DNA praimaasid. RNA praimeritelt jätkab sünteesi DNA polümeraas III. DNA polümeraas I eemaldab RNA praimerid DNA-ahelast ja asendab need DNA lõikudega. Ensüüm DNA ligaas katalüüsib üksikahelaliste DNA katkete sulgumist. DNA helikaas keerab DNA ahelaid lahti, kasutades ATP energiat DNA topoisomeraas teeb DNA ahelatesse ajutisi katkeid, et soodustada DNA ahelate lahtikeeramist.
Sünteesi käigus lisatakse desoksüribonukleosiid trifosfaate, lühendatult dATP, dGTP, dCTP ja dTTP. Lisamise käigus lõigatakse ära 2 fosforhappejääki ja DNA ahelasse liitub desoksüribonukleosiid monofosfaat, lühendatult dAMP, dGMP, dCMP, dTMP. Süntees on alati 5’-3’ suunas. Uue nukleotiidi suhkrujäägi 5’ ots liidetakse eelmise nukleotiidi 3’ otsaga fosfaatjäägi kaudu. Samaaegselt toimub DNA lahtikeerdumine ja replikatsioon. Ori-regioonid on alati A-T rikkad, praimeriks DNA või RNA või valguga seondunud nukleotiidid, praimerit on vaja selleks, et polünukleotiidahelal oleks vaba 3-OH ots, kuhu DNA-polümeraas saaks liita nukleotiide. 15. Milline ülesanne on replikatsioonis helikaasidel ja topoisomeraasidel Helikaasid - ensüümid, mis vastutavad DNA kaksikheeliksis vesiniksidemete lõhkumise eest aluspaaride vahel Topoisomeerid - ensüümid, mis leevendavad torsiooni jõude sinna katkeid tehes (et nö pinge välja lasta)
Teatud juhtudel võib DNA replikatsioon alata ka DnaA-st sõltumatult ning teistest kromosoomipiirkondadest stabiilne DNA replikatsioon SDR. 29. DNA replikatsiooni initsiatsiooni mehhanismid oriC'lt bakteris E. coli. DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga. Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Erinevate DNA molekulide replikatsiooni puhul võib praimeriks olla kas DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas (ingl. k. primase). DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni toimel (faagid T4, T7, mõned ColE1 replikoni sisaldavad plasmiidid E. coli´s) või spetsiifiliste valkude seondumise tulemusena (DnaA oriC puhul, O ori puhul). Kuna DNA dupleksi avamine on lihtsam A-T rikastest regioonidest, on ori regioonid alati A-T rikkad
Sünteesi viivad läbi polümeraasid. Matriitsina toimib üksikahelaline nukleiinhape. Seega peab kaksikahelaline DNA replikatsiooni initsiatsioonisaidist olema eelnevalt viidud üksikahelaliseks. DNA ahelate eraldumist teineteisest katalüüsib DNA helikaas. Nukleiinhapete sünteesi läbiviivad polümeraasid: 1. DNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Toimub DNA replikatsioon. Vajab sünteesil praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga. Praimeriks on lühike oligonukleotiid (DNA või RNA ahel) 2. RNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Toimub transkriptsioon. Transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega ning seejärel katkevad promootrorpiirkonnas DNA ahelate vahelised vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit. 3. Pöördtranskriptaas e
Sünteesi viivad läbi polümeraasid. Matriitsina toimib üksikahelaline nukleiinhape. Seega peab kaksikahelaline DNA replikatsiooni initsiatsioonisaidist olema eelnevalt viidud üksikahelaliseks. DNA ahelate eraldumist teineteisest katalüüsib DNA helikaas. Nukleiinhapete sünteesi läbiviivad polümeraasid: 1. DNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Toimub DNA replikatsioon. Vajab sünteesil praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga. Praimeriks on lühike oligonukleotiid (DNA või RNA ahel) 2. RNA polümeraas ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Toimub transkriptsioon. Transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega ning seejärel katkevad promootrorpiirkonnas DNA ahelate vahelised vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit. 3. Pöördtranskriptaas e
raku jagunemise. Tütarkromosoomide dekatenatsiooni häirete puhul tekivad mõne aja pärast filamentsed rakud. DNA replikatsiooni initsiatsioon DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga. Nimetus ori tuleneb inglisekeelsest terminist "origin of replication". Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Erinevate DNA molekulide replikatsiooni puhul võib praimeriks olla kas DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas (ingl. k. primase). DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni toimel (faagid T4, T7, mõned ColE1 replikoni sisaldavad plasmiidid E. coli´s) või spetsiifiliste valkude seondumise tulemusena (DnaA oriC puhul, O ori puhul). Kuna DNA dupleksi avamine on lihtsam A-T rikastest regioonidest, on ori regioonid alati A-T rikkad.
annaabi.ee 
