iseloomustava teguri k=>0,1. Seejärel mõõdetakse geelisamba kõrgus L=>12,5 cm ja ja diameeter d=>2,7 cm. Arvutatakse täidise kogumaht Vt=>71,53 Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt=>7,15 ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vx max = Vt – Vg=>64.38. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2=>32,19. Katseklaasistatiivi asetatakse fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdatakse. Seejärel pandi kirja eluent=> NaCl 0,15 M. Varutakse väike keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine Kui ettevalmistused said tehtud võis avada kolonni väljavooluava. Kui vedeliku tase
kasutatava geeli pundumisastmest, oli 0,1. Geelisamga kõrgus L oli 22,2 ja diameeter d oli 1,8 Täidise kogumaht Vt= r 2 * L = *( 1,8/2)2 * 22,2= 56,46 Geelmaatriksi maht Vg= k*Vt= 0,1 * 56,46= 5,6 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg = 56,46 5,6=50,86 Fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni maht on 2ml, seega n=Vxmax/2 =50,86/2=25,2 Katseklaasistatiivi asetasin 25 nummerdatud klaasi, kus olid eelnevalt tehtud 2ml piirid. Voolutuslahuseks ehk eluendiks oli 0,15M NaCl, eluendi kolonni viimiseks kasutasin 10ml pipetti. 50ml keeduklaasi kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi. Segu komponentideks lahutamine Avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt anumasse tilkuma. Samal ajal reguleerisin kolonni voolukiiruse nii, et 2ml täituks 2-3 minutiga
Aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nim. kromatogrammiks. Töö käik Kolonni iseloomustavad parameetrid: Kasutatav geel: Sephadex G-75 Geeli pundumisaste k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 17 Täidise diameeter d= 2,5; r = 1,25 Täidise kogumaht Vt= П*r2*L => 3,14* 1,252*17=83,41 Geelimaatriksi maht Vg= K*Vt => 0,1*83,41=8,341 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg => 83,41-8,341 = 75,069 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/2 => 42,84/2 = 37,5 Katseklaasistatiivi asetati 38 katseklaasi nummerdatult. Seejärel avati kolonni väljavooluava ja reguleeriti kiirus optimaalseks (2 ml fraktsiooni kogumiseks kulub 2-3 minutit). Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, suleti kolonni väljavooluava ja kolonni sisestati pipetiga 0,5 ml uuritav proov, mis koosnes dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP- aspartaadist. Seejärel lisati vooluti, mis tagas, et uuritava proovi imendumise geeli. Kui proov
Sephadex G-75, pundumistegur k= 0,1. · Mõõden geelisamba (täidise) kõrgus L ja diameeter d, kasutades sobiva joonlauda. L=32,5 cm. d=1,9 cm. · Arvutan täidise kogumaht Vt . · Arvutan geelimaatriksi maht Vg . · Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml. n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42 · Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. · Voolutuslahus:Dekstraansinine,Müoglobiin,DNP-Aspartaat.Kasutasin automaatpipetti mahuga 0,5 ml. · Kolonni pinnal olev eluent kogun seisukolbi. Segu komponentide lahutamine: Avan kolonni väljavooluava. Täidise lahus hakkab keeduklaasi tilkuma. Reguleerin kolonni voolukiirus piiridesse 0,7-1,0 ml/min. Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan
Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kolonn asetataksse statiivile vertikaalselt · Kolonni täidise mark ja seda iseloomustav tegur k märgitakse üles. · Mõõdetakse geeli kõrgus L ja diameeter d. · Arvutatakse geeli kogumaht Vt. · Arvutatakse geelmaatriksi maht Vg ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml. · Katseklaasistatiivi asetatakse arvule n vastav katseklaaside hulk, nummerdatakse. · Valmistatakse ette voolutuslahus ja leitakse sobiv pipett lahuse kolonni viimiseks. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu kogutakse geeli pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine · Avatakse kolonni väljavooluava ning kogutakse täidise kohal olev eluent keeduklaasi. · Reguleeritakse kolonni voolukiirus sobivaks: 0,7 1,0 ml/min. · Vedeliku tase lastakse joosta geeli pinnani ning suletakse väljavooluava
· Märkisin ples kasutatava kolonni täidiseks oleva Serphadex'i margi ja seda iseloomustava teguri k. Sephadex'i mark: Tegur k: · Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrguse L ja diameetri d. Täidise kõrgus: Täidise diameeter: · Arvutasin täidise kogumahu . · Arvutasin geelmaatriksi mahu ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu . · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml. · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerasin. · Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ja märkisin üles eluendi koostise. Varusin 25 ml pipeti, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väikese (50 ml) keeduklaasi, kuhu kogusid kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lasin. Segu komponentide lahutamine.
L = 17,6 cm d = 3 cm Arvutasin täidise kogumahu Vt. Vt = L * r2 * = 17,6 * 1,52 * = 124,4 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueelirimismahu Vxmax = Vt - Vg Vg = 0,1 · 124,4 cm3 = 12,44 cm3 Vxmax = 124,4 cm3 12,44 cm3 = 111, 96 cm3 Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2ml; seega n = Vxmax / 2 = 111,96 cm3 / 2 = 55, 98 56 Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi ( 2ml ) kalibriitud katseklaase ja numereerisin need. Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahutuse ehk eluendi pudeli ja märkisin üles voolutuslahuse koostise: 50 mM Tris HCl 150mM NaCl pH = 7,5 Varusin väikse keedkulaasi, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lasin. 2.2. Segu komponentide lahutamine
80000 daltonit. Kolonni iseloomustav tegur k=0,1 Geelisamba kõrguseks mõõtsin: L=18 cm Geelisamba diameetriks mõõtsin: d=2,8 cm r=1,4 cm Arvutan täidise kogumahu: Vt=r2**L Vt=1,42*3,14*18=110,78 cm3 Arvutan geelimaatriksi mahu: Vg=k*Vt Vg=0,1*110,78=11,08 cm3 Arvutan maksimaalse elueerimismahu: Vxmax=Vt-Vg Vxmax=110,78-11,08=99,7 cm3 Ühe fraktsiooni maht: 2 mL Arvutan fraktsioonide üldarvu: n=Vxmax/2 n=99,7/2=49,85=50 fraktsiooni. Asetasin katseklaasistatiivi vastavalt fraktsioonide üldarvule 50 katseklaasi, mis olid kalibreeritud 2 mL fraktsioonide võtmiseks. Voolutuslahuse koostis: pH=7,5; 20mM Tris/HCl; 0,15M NaCl Segu komponentide lahutamine Avasin kolonni väljavooluava ja lasin täidise kohal oleval voolutuslahusel keeduklaasi tilkuda ise samal ajal jälgides, et ma ei laseks kolonni kuivaks joosta. Vedeliku nivoo ei tohtinud langeda alla geelipinda, mis oleks õhul lasknud geelikihti tungida.
·Mõõtsin geelisamba kõrguse L ja diameetri,kasutades sobivat joonlauda.n L=28cm; d=2.2cm. ·Arvutasin täidise kogumahu Vt= r 2 *L= *1.1²*28=106 cm³ ·Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg=k*Vt=0.1*106=10.6 ja sellest lähtuv kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimistmaht Vx;max=Vt-Vg=106-10.6=95.4 ·Arvutasin fraktsioonide üldarvu, arvestan kindlaks mahuks 2ml. n=Vx;max/2=95.4/2=47.7. (Kuigi selline arvutus, läks mul vaja 36 katseklaasi). ·Asetasin katseklaasistatiivi fraktsiooni arvule vastava hulga kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdan. ·Paigutasin kolonni lähedusse voolutuslahuse (eluendi) pudeli ja märkisin üles selle koostise. Varusin sobiva mahuga (20ml,25ml) pipeti, millega voolutuslahus kolonni viia. ·Varusin väikese (50ml)seisukolvi, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine
Selleks, et leida kogumahu, tuleb esiteks leida aluse pindala: S = r2 = · 0,92 2,54cm2 Ning arvutasin kogumaht: Vt = S · L = 2,54 · 31 78,74cm3 · Arvutasin geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg: Vg = 0,1 · 78.88 = 7,87 cm3 Vxmax = 78,74 7,87 = 70,87cm3 · Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,44 · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine.
S = r2 = · 0,92 2,54cm2 Ning arvutasin kogumaht: Vt = S · L = 2,54 · 31 78,88cm3 · Arvutasin geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg: Vg = 0,1 · 78.88 = 7,89 cm3 Vxmax = 78,88 7,89 = 70,99cm3 Selline täpsus pole õigustatud! · Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,45 · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine.
joonlauda. NB! Täidise diameetri mõõtmine eeldab kolonni sisediameetri võimalikult täpset määramist nihkkaliibri või joonlaua abil. · Arvutatakse täidise kogumaht Vt. · Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg. · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2. · Katseklaasistatiivi asetatakse fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdatakse. · Kolonni lähedusse paigutatakse voolutuslahuse (eluendi) pudel ja märgitakse üles voolutuslahuse koostis. Varutakse sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varutakse väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise
annaabi.ee 
