Nobeli preemia 1965. Uurisid kaht eri mutatsiooni selles operonis: 1. Mutatsioonid valku kodeeriavates järjestustes 2. Mutatsioonid regulatoorsetes järjestustes 1. Mutatsioonid valku kodeerivates järjestustes: lacZ (galaktosidaas) knockout mutandid inhibeeritud samuti laktoosi permeaas (lacY) ja transatsetülaas (lacA). lacY (lactoosi permeaas)knockout mutandid inhibeerivad transatsetülaasi (lacA), kuid ei mõjuta galaktosidaasi (lacZ). lacA (transatsetülaas) knockout mutadid ei mõjuta ei galaktosidaasi (lacZ) ega laktoos permeaasi (lacY). Järeldus: lac operoni geenid aheldunud ja järjestus järgmine: 1. lacZ kodeerib galaktosidaasi 2. lacY kodeerib laktoosi permeaasi 3. lacA kodeerib transatsetülaasi E. coli lac operoni translatsioon metsikul ja mutantsel tüvel 2. Regulatoorsete järjestuste mutatsioonid ja selle mõju ekspressioonile:
laktoosi glükoosiks ja galaktoosiks; lacY ja lacA. Üleval: Kui keskkonnas ei esine laktoosi (mis inhibeeriks repressorit), repressor seondub operaatoriga. See takistab RNA-polümeraasi seostumist ning B-galaktosidaasi tootmist ei toimu (laktoosi rakkus on vähe). Kui laktoosi on palju (alumine), see blokeerib repressorit. RNA polümeraas seondub promootoriga ning sünteesitakse B-galaktosidaasi, mis lõhustab laktoosi. Kui laktoosi saab väga vähe, siis algab kõik uuesti.
Hüdrolüütilised ensüümid. 13. Mille järgi on võimalik määrata mikroobi trüptofanaasset aktiivsust? Indooltestiga. Trüptofaan lagundatakse indooliks. Kasutatakse lisaks Kovacsi reaktiivi. Erepunane värvus. Kasutatakse LB söödet. Indooli kuhjub ja seda ei metaboliseerita. 14. Mida peab sisaldama indooltesti tegemiseks kasutatav sööde? Trüptofaani. 15. Kuidas määrata laktoosi kasutamist mingi mikroobi poolt? Endo testiga. BGLB. β-galaktosidaasi testi. Nitrofenool – kollane ühend. 16. Kas saame võrdustada β-galaktosidaasi testi laktoosil happe moodustamise testiga? Ei saa, ensüümi aktiivsust näitab vaid β-galaktosidaasi test. 17. Mida näitab nn oksüdaastest? Kas redutseerunud cytc annab elektronid molekulaarsele hapnikule → tekib vesi ja hapnik. 18. Milliste mikroobirühmade (gramreaktiivsus) eristamisel on oluline oksüdaastest? GN pulkbakterite ja kokkide eristamiseks 19
kokku. Meie valitud vektor sisaldab ka antibiootikumiresistentsuse geeni ka β-galaktosidaasi kodeerivat lacZ operooni. Kui inserd ligeeris vektoriga kokku, siis see vektor enam ei kodeeri ensüümi, mis lõhub β-
sisaldavad keskkonnas seeläbi saab vähendada ohtu, et plasmiidi mitte sisaldavad rakud tekitavad saaste. Vektor sisaldab lacZ operoni, mis võimaldab kasutada inserti sisaldavate rakukolooniate tuvastamiseks sini-valge meetodit. Lisaks sellele on vektoris palju erinevaid restriktsioonisaite, see võimaldab vektorisse sisestada erinevate restriktaasidega töödeldud otstega inserte. d) Plasmiid sisaldab lacZ operoni, mis kodeerib -galaktosidaasi. Kui kasvusöötmele lisada X-gali (laktoosi analoog, kus galaktoosiga on glükoosi asemel seotud inool), siis rakkudes, kus lacZ lugemisraam on terve, hüdrolüüsib -galaktosidaas X-galis glükosiidsideme, vabanevad galaktoos ja 5-bromo-4-kloro-3-hüdroksüindool, millest viimane dimeriseerub ja oksüdeerub tekib indigosinist värvi dikloro-dibromo-indigo, mis värvib indigosiniseks terve koloonia.
molekuli. DNAde otsad seovad komplementaarselt kokku ligaasi abil. 44. Me kasutasime kloneerimiseks pSTBlue-1 vektorit (T-overhangidega), kuhu saab sisestada saadud DNA järjestuse (A-overhangidega inserdi 3’ otsades). Toimub A-T otste komplementaarne paardumine ning vektor ja DNA ligeeritakse. 45. 46. pSTBlue-1 vektor sisaldab replikatsiooni vajaliku origini, antibiootikumiresistentsuse geeni ning ka lacZ operooni, mis annab bakterile lisatoitumisallika, kuna kodeerib β-galaktosidaasi. β-galaktosidaas lõhub β1-4 glükosiidsidet ja erinevaid substraate ette söötes saame kindlaks teha, millised meie kasutatud bakterikoloonuatest sisaldavad tühja plasmiidi ja millistel on insert seda ensüümi kodeeriva järjestuse „ära rikkunud“. 47. Ligeerimiseks tuleb pipeteerida kokku ligeerimissegu (5 μl), segada pipeti või vorteksi abil, vajadusel fuugida ning jäta ligeerimiseks järgmise päevani +4 °C juures. Ligeerimissegu:
(ca 15-20 ml ühele tassile). Liiga kuumas (>60 oC) söötmes antibiootikum laguneb! Tassid tarduvad ~15 min pärast. Iga üliõpilane saab ühe Petri tassi ja kirjutab oma nime plaadi äärde (sellele poolele, kus on agar). (7) Transformeeritud rakkude külvamine Petri tassidele: Transformeeritud rakkude tuubi lisa 10 l IPTG ja 10 l X-gali lahust, sega korralikult, kuid ära tsentrifuugi! Nende substraatide lisamine on vajalik beta-galaktosidaasi ekspressiooniks, mis võimaldab identifitseerida bakteri kolooniad, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid). (8) Saadud segu (230 l) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka. Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega. (9) Paiguta saadud tassid ümberpööratult 37 oC inkubaatorisse. Kolooniate värvusreaktsioon (sinine/valge) ilmneb 12-20 h pärast
Tassid tarduvad ~15 min pärast. Iga üliõpilane saab ühe Petri tassi ja kirjutab oma nime plaadi äärde (sellele poolele, kus on agar). Nime tuleb kirjutada plaadi äärde, selleks et edasi oleks võimalik eristada sinised ja valged kolooniad. (7) Transformeeritud rakkude külvamine Petri tassidele: Transformeeritud rakkude tuubi lisa 10 l IPTG ja 10 l X-gali lahust, sega korralikult, kuid ära tsentrifuugi! Nende substraatide lisamine on vajalik beta-galaktosidaasi ekspressiooniks, mis võimaldab identifitseerida bakteri kolooniad, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid). (8) Saadud segu (230 l) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka. Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega. (9) Paiguta saadud tassid ümberpööratult 37 oC inkubaatorisse. Kolooniate värvusreaktsioon (sinine/valge) ilmneb 12-20 h pärast
Keskkonnamikrobioloogia konspekt 2005; Tri Kolledz 15 Coli-laadsete ja fekaalsete coli-laadsete mramiseks kasutatakse piirlahjenduste ja membraanfiltrite meetodeid. Veel rakendatakse on/ei ole ehk +/- (presence/absence) teste, mis phinevad coli-laadsete bakterite omadusel lagundada teatuid substraate, mille tulemusena tekib vrviline produkt. Coli-laadsete bakterite puhul on substraadiks isopropl-.-D- tiogalaktopranosiid (IPTG) - kasutatakse .galaktosidaasi detekteerimiseks. E. coli puhul on substraadiks o-nitrofenool-.-D- galaktopranosiid-4metlbelliferl- .-D-glkouroniid (MUG)- kasutatakse .-glkouronidaasi detekteerimiseks. Tuntumad kommersiaalsed tooted on Colilert test ja Colisure. Veel kasutatakse geeniproove ja PCR meetodeid (lacZ coli-laadsed, uidA ja uidR E. coli). Siin on probleemiks kvantifitseerimine. Mitmed uurimistd on nidanud, et coli-laadsete bakterite arvukus ei ole kvantitatiivselt seotud patogeensete
hape on äädikhape. 44 Tsellulaas Katalüüsib beeta-1,4-glükosiidse sideme hüdrolüüsi. Beeta-glükosidaas Hüdrolüüsib -sidet, -glükosiidid ei lähe. Spetisifiline just glükoosi suhtes, teise asendaja suhtes R pole spetsiifiline. -galaktosidaasi puhul on substraadil OH teistpidi, väga spetsiifiline ensüüm. Karboksüpeptidaas O O H2N O NH O R + H2O R OH +
eukarüootidel palju reguleerivaid piirkondi, kuhu saavad seostuda erinevad transkriptsioonifaktorid. Kui transkriptsioonifaktorit pole, siis asi ei tööta – faktor mõjub positiivselt. Regulaator paneb geenid tööle. Kui regulaatorit pole, siis geen on väljalülitatud. DNA on pakitud kromatiini – DNA tuleb kättesaadavaks teha sünteesiks ja selleks vajatakse regulaatorit. Ilma regulaatorita on geen välja lülitatud. Lac-operon, kolm geeni 1) LacZ – ensüüm β-galaktosidaasi kodeeriv geen, lagundab laktoosi; vajalik pentoosfosfaadi tsüklis. Koosneb neljast valgust. 2) LacY – membraanivalk, permeaasi (transportvalku) kodeeriv geen; võimaldab laktoosil rakku vast võtta. Pääseb väga aeglaselt. Permeaasita on laktoosi kontsentratsioon väiksem raku sees kui ümbritsevas keskkonnas. 3) LacA – transatsülaas, ensüümide aktiveerimiseks; laktoosi esmane lagundaja 50
otsad ei saa vabalt pöörelda ning DNA superspiraliseerub. DNA superspiralisatsioonil on kaks tähtsust: pakkida DNA-d ning reguleerida replikatsiooni ning transkriptsiooni. Kõrvutades E. coli raku pikkust kromosoomi pikkusega on ilmselge, et bakter on tunduvalt lühem kui tema sees olev DNA. Logaritmilises faasis kasvab bakter kiiresti ning E. coli pikkus ulatub kuni 2 m-ni, samas näiteks E. coli lac-operon koosneb kolmest geenist lacZ, lacY ja lacA (kodeerivad vastavalt -galaktosidaasi, laktoosi permeaasi ja galaktosiid O- atsetüültransferaasi) ning on umbes 1,7 m pikkune kui arvestada nukleotiidse järjestuse pikkust. Kui arvesse võtta 4639 valku kodeerivat geeni, ulatub E. coli tsirkulaarne DNA 1,5 mm-ni. Need võrdlused näitavad ilmekalt, et bakter peab DNA-d väga efektiivselt pakkima ning lisaks veel operatiivselt võimaldama DNA- d replitseerida ning transkribeerida. Mis tähendab, et bakter peab DNA lahti harutama ning uuesti pakkima. 9.1
annaabi.ee 
