Teooria. Glukoosisisalduse kvantitatiivseks maaramiseks bioloogilistes vedelikes kasutatakse laialdaselt ensumaatilist meetodit, mis pohineb kahe ensuumiglukoosi oksudaasi (GOD) ja peroksudaasi (POD) kasutamisel. Tanu GOD-i substraadispetsiifilisele b, D-glukoosi suhtes voimaldab see meetod maarata glukoosisisaldust ka teiste taandavate suhkrute juuresolekul. GOD kujutab endast liitvalku- flavoproteiini, sisaldades proteetilise grupina FAD, mis toimub kui koensuum. Ta oksudeerib glukoos glukoonhappeks ja tekib viimasega ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi. +O2 (GOD FAD->FADH2) +H2O COOH-(HCOH)4-CH2OH +H2O2 POD on koostiselt liitvalk kromoproteiin, mis sisaldab prosteetilise ruhma heemi. POD kataluusib spetsiifiliste substraatide oksudeerumist. Reaktsiooni pohimotteline skeem on sellinne: POD
Tänu GOx-i substraadispetsiifilsusele -D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx-i süstemaatiline nimetus -D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas näitab, et ta katalüüsib ,D- glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Produktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. GOx kujutab endast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx on dimeerne valk. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab molekulaarsele hapnikule, mille tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas
meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. GOx-i süstemaatiline nimetus ,D-glükoosi: O2-oksüdoreduktaas näitab, et ta katalüüsib, D glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja ,Dglükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. GOx kujutab endast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. Vaadeldava meetodi järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor: H2O2 oksüdoreduktaas. POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide
3.3. Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. GOx-i süstemaatiline nimetus on ,D-glükoosi:O2-oksüdorektaas (EC 1.1.3.4) näitab, et ta katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. GOx kujutab ennast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimub koensüümina. Järgmises etappis kasutatakse peroksüdaaside esindajat, rõika peroksüdaasi (EC 1.11.1.7), mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. Kui kasutata substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine:
Tänu glükoosi osküdaasi substraadispetsiifilisusele glükoosi suhtes võimaldab meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. Glükoosi oksüdaas katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. Glükoosi oksüdaas kujutab endast joonisel näidatultki liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi , mis toimib koensüümina. Glükoosi oksüdaasi molekul on dimeerne valk (kaks subühikut, mis joonisel on eritooniliste siniste värvustega näidatud). Roosaga on joonisel näidatud FAD-i molekulid. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad, mis on tähistatud rohelisega. Glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit seob FAD, redutseerides -ks ja kannab need
Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele ,D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx-i süstemaatiline nimetus ,D-glükoosi:O2-oksüdoreaduktaas (EC 1.1.3.4) näitab, et ta katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Produktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsides moodustab D- glükoonhappe. GOx kujutab endast liitvalku, täpsemalt flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponentina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad. FAD seob glükoosi molekulilt 2 vesiniku aatomit, redutseerides FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükooshapet ja vesinikperoksiidi.
Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele β,D- glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx-i süstemaatiline nimetus β,D-glükoosi:O 2-oksüdo-reduktaas näitab, et ta katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D- glükoonhappe. GOx kujutab endast liit- ehk konjugeeritud valku (flavoproteiini), mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk (kaks subühikut). Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad. FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH 2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.
hävinemist sealt keskkonnast. Lisaks on leitud ka obligatoorsete anaeroobide alla kuuluvaid baktereid, kes on võimelised sünteesima superoksiidi dismutaasi ja katalaasi. Kuid need anaeroobid, kes tõesti ei sünteesi superoksiidi dismutaasi ja katalaasi, toetuvad teistele mehhanismidele. Üks meetod, mida kasutatakse nende organismide poolt, kes ei kasuta hapnikust-sõltuvat metabolismi, hõlmab unikaalset flavoproteiini NADH oksüdaas, mis katalüüsib hapniku otsest nelja elektroni reduktsiooni veeks. 1 Teine meetod, mis kaitseb oksüdatiivse stressi eest on superoksiidi reduktaasi süsteem, mis esineb näiteks bakteritel Desulfovibrio vulgaris ja Pyrococcus furiosus. Ta redutseerib superoksiidi vesinikperoksiidiks ilma dismutaasita ning selle süsteemi eeliseks on superoksiidi elimineerimine ilma molekulaarse hapniku tekketa. Selle süsteemi funktsioon on koostoimes NADH peroksüdaasiga, mis
ATP süntaas koosneb kahest subühikust, üks neist (F0) paikneb sisemembraanis ja moodustab poori, mille kaudu prootonid saavad maatriksisse sisenega ning F1, mis katalüüsib ATP sünteesi. Praktiliselt saab hingamisahelat jagada neljaks kompleksiks. I kompleks võtab NADH + H+ elektronid ja annab need koensüüm Q-le. See on NADH dehüdrogenaas. Prootonid lasevad alga sisemembraani välisküljele ja coQ redutseerub coQH2. II kompleks (flavoproteiini hüdrogenaas) võtab elektronidepaari FadH2 ja annab selle ka coQ-le. Selle tulemusel prootoneid ei väljutata. III kompleksis kannab reduktaas elektronid coQH2 kahele tsütokroom c-le ja IV kompleksis võtavad kaks tsütokroomi a ja a3 elektronid vastu tsütokroom c-lt ning annavad hapnikule, mille mõlemad aatomid võtavad 2 elektroni. ATP, ADP ja Pi transport läbi membraani ATP ja ADP transport toimub mitokondri sisemembraanis paikneva ATP-ADP
rakkudes on olla elektronide doonoriks tsütokroom P450 sisaldavatele ensüümidele. Analoogiline valk on ka pärmi mitokondrites, kus P450 puudub. Ferredoksiini homoloogi deletsioon pärmis on letaalne ning praeguseks on selge, et ta osaleb FeS klastrite assambleerimisel. FMN ehk flaviinmononukleotiid on kompleks I perifeerse osaga tugevalt seotud kofaktor. Seega on kompleks I flavoproetiin. Elektronide allikana ubikinooni redutseerimisel funktsioneerivad kokku 4 erinevat flavoproteiini: 1. Kompleks I 2. Kompleks II 3. ETF ehk elektrone ülekandev flavoproteiin-dehüdrogenaas 4. glütserool-3-fosfaadi dehüdrogenaas Kompleks II – suktsinaadi dehüdrogenaasi kompleks Kompleksi II tuntakse kui suktsinaadi dehüdrogenaasi või suktsinaat:CoQ oksidoreduktaasi. Elektronide liikumist läbi selle kompleksi iseloomustab ΔEo’ 0.05V, millele vastav ΔGo’= -9.6 kJ/mol iga ülekantud elektronide kohta. Seda ei ole piisavalt ATP sünteesiks
I0 -- , l -- , , k -- 10. Oletagem, et teil tuleb valmistada tahkest ensüümipreparaadist 10 ml lahust kontsentratsiooniga 4,5 mg /ml. Kuidas toimite? 3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL 1.Millisesse ensüümide klassi kuuluvad GOx ja POx? 27 glükoosi oksüdaas (GOx) ja peroksüdaas (POx) GOx endast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin 2.Kirjeldage GOx-i ja POx-i poolt katalüüsitavaid reaktsioone. GOx ( ,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas), ta katalüüsib ,Dglükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja
reduktaas (EC 1.1.3.4) näitab, et ta katalüüsib ,D- glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja ,D- glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe. Nagu juuresolevalt pildilt näha, kujutab GOx endast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk (kaks subühikut, pildil erineva sinise tooniga). Roosaga on näidatud FAD-i molekulid. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad (tähistatud rohelisega). FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas.
annaabi.ee 
