· Geelisamba kõrgus L=33 cm ja diameeter d=1,6 cm · Täidise kogumaht Vt=L** =33* * =66,35 ml · Geelimaatriksi maht Vg = k · Vt=0,1*66,35=6,635 ml maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg= 66,35-6,635=59,715 ml · Fraktsioonide üldarv n, ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax/2=59,715/2=30 · Elueerimislahus 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl pH 7,4 Optiline Elueerumismaht Fraktsiooni nr tihedus, A V, ml ühendatud fraktsioon 0 20 1 0,0463 670 Lainepikkusel 22 2 0,1993 24 3 nm 0,0706 26
täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl 2 Mõõtmistulemuste tabel Fraktsiooni number Elueerumismaht V (ml) Optiline tihedus (A) Ühendatud fraktsioon 25 0 1 27 0,042 2 29 0,2026 3 31 0,1868 4 33 0,0674 5 35 0,0253 6 37 0,1283
· Mõõtsin kõigi fraktsioonide neeldumismaksimumid spektrofotomeeril. Eelnevalt oli kolonnist jõdnud läbi voolata 17,5ml eluaati, alates millest hakkasin fraktsioone koguma. Fraktsioonides 1-4 mõõtsin neelduvusmaksimumi sinise värvi lainepikkusel 625nm Fraktsioonides 4-13 mõõtsin neelduvusmaksimumi pruuni värvi lainepikkuse 410nm Fraktsioonides 14-24 mõõtsin neelduvusmaksimumi kollase värvi lainepikkusel 360nm Fraktsiooni nr Elueerumismaht V, ml Optiline tihedus, A 1 19,5 0,009 2 21,5 0,153 3 23,5 0,152 4 25,5 0,033 5 27,5 0,6083 6 29,5 1,7289 7 31,5 2,1229 8 33,5 1,3704 9 35,5 0,5706
Kokku tuli 20 ml ühendatud fraktsiooni. Kui tuli sinine riba asendasin mõõtsilinder katseklaasiga ja hakkasin koguma fraktsioonid. Kokku tuli 42 fraktsiooni. Fraktsioonide analüüsimine: Analüüsin saadud fraktsioonide absortsiooni tihedused spetrofotomeetril. Dekstraansinine optiline tihedus vaatasin 670 nm lainepikkusel, müoglobiin- 410 nm, DNP-aspartaat- 360nm.Sisestan saadud andmed tabelisse. Katseandmete tabel. Fraktsiooni nr Elueerumismaht, V ml Optiline tihedus, A Ühendatud fraktsioon 20 0 1 22 0,043 2 24 0,237 3 26 0,175 4 28 0,124
mis täielikult pooridesse mahuvad. 3. Milline ühine omadus iseloomustab kõiki geelkromatograafia kolonnide täidisena kasutatavaid materjale? Kõik materjalid on polümeerid ja geeli pooridesse ei mahu ükski molekul, mis on samas suurusjärgus või suurem, kui antud geeli poor. 4. Miks ei tohi kolonnist eluaati koguda liiga kiiresti? Kui elueerida liiga kiiresti, siis erinevad molekulid ei jõua lahutuda ning nad väljuvad seguna. 5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx. Aine elueerimismaht on sellise eluaadi maht, milles oleva aine kontsentratsioon on kõige suurem 6. Mida näitavad kolonni minimaalne ja maksimaalne elueerumismaht? Minimaalne võrdne graanulitevahelise vedeliku mahuga ja maht, mille juures väljub esimene aine maksimaalse kontsentratsiooniga Maksimaalne lähedane kolonni mahule ning maht, mille juures viimane aine väljub maksimaalse kontsentratsiooniga. 7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul
36 111 0,015 37 113 0,01 38 115 0 Kogu eluaadi maht: 33+238=109 (ml) Graafikult on näha kolme tõusu ja langust, mis näitavad, et aine konts. kolonnist väljumisel tõuseb, saavutab haripunkti ja langeb, kuni kogu aine on kolonnist väljunud. Ained jagunesid geelis vastavalt molaarmassile. Dekstraansinine, mille molaarmass oli suurim, väljus kolonnist esimesena. Tema elueerumismaht on minimaalne. Kolmandana elueerus DNP- aspartaat, mille molekulid olid lahuses väikseimad ning difundeerusid täielikult geeli pooridesse. Seetõttu on DNP-Aspartaat maksimaalse elueerimismahuga. Müoglobiin väljus kohe pärast dekstraansinist, st tema molekulmass on dektraansinisest veidi väiksem. Müogobiini ja DNP-aspartaadi väljumise vahe oli suurem, st DNP-aspartaadi molekulid on oluliselt väiksemad müoglobiini omadest.
Fraktsioonide analüüsimine Ainete kontsentratsiooni antud töös väljendatakse igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritava ainesegu koostisest: dekstraansinine- 670 nm, aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (türosiin Tyr, fenüülalaniin Phe, trüptofaan Trp) - 280 nm ja DNP-aspartaat- 360 nm. Katseandmete tabel Fraktsiooni nr Elueerumismaht ml Optiline tihedus, A Ühendatud fraktsioon 16,75 0 1 18,75 0,0961 2 20,75 0,1959 670 nm 3 22,75 0,3551 4 24,75 0,6745 5 26,75 0 6 28,75 0,0661 7 30,75 0,0520
aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Uuritavatele ainete iseloomulikud neeldumismaksimumid on: - Dekstraansinine 670 nm - müoglobiin 410 nm - DNP-aspartaat 360 nm 1. Mõõdan puhta eluendi (eeljooksu) mahu, mille kogusin üheks suureks fraktsiooniks V = 21,5 ml Katsetulemused: Lainepikkus (nm) Fraktsiooni nr. Elueerumismaht Optiline tihedus, V, ml A Ühendatud 21,5 0 fraktsioon 1 23,5 0,0044 DEKSTRAANSININ 2 25,5 0,0061 E
agaroosist (lineaarne punavetikatepolüsahhariid, vi polüakrüülamiidist. 4. Miks ei tohi kolonnist eluaati koguda liiga kiiresti? Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda Voolukiirus peab olema optimaalne, et tsooni laienemist põhjustava massiülekande ja difusiooni mõju lahutuvusele oleks võimalikult väike. 5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne. Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. 6
55 värvusetute fraktsioonide numbrid ja elueerumismahud, märkides nende optilise tiheduse väärtuseks 0. NB! Kuna iga segus sisalduva aine optilise tiheduse väärtust mõõdetakse ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel max, siis ei tohi unustada spektro- fotomeetrit vastavale lainepikkusele reguleerida! Katseandmete tabel Fraktsiooni nr Elueerumismaht Optiline tihedus, A V, ml Ühendatud fraktsioon 0 1 2 3 ... Tulemused ja nende interpreteerimine A. Esitatakse kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid: ¾ täidise materjal ja mark, ¾ täidist iseloomustav pundumistegur k, ¾ täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter,
annaabi.ee 
