Geeni transkriptsioon ja RNA protsessing Alternatiivne splaising Koepetsiifiline splaising esineb sageli eukarüootsetel geenidel: tekivad erinevad transkriptid ja valgud Transkriptsiooni faktorid Geenide ekspressiooniks on vaja transkriptsiooni faktoreid: – Üldised transkriptsiooni faktorid (GTF; general transcription factors) on vajalikud transkriptsiooni alustamiseks – aitavad RNA polümeraasil seonduda DNA-ga. – Spetsiifilised transkriptsiooni faktorid võimendavad ekspressiooni erinevates rakutüüpides või vastusena rakuvälistele signaalidele. Neli tavalisemat DNA-ga seonduvat valgu struktuuri: – Heeliks-pööre-heeliks
ja väikestele molekulidele, seega on selle ala ensüümide Maatriksis sisalduvad ka mitu identset koopiat sisaldus sarnane tsütosooliga. mitokondriaalsest DNA genoomist, mitokondri ribosoomid, tRNAd ja mitmed ensüümid mitokondri geenide ekspressiooniks. Mitokondrid Valgu liikumine läbi kahe membraani vajab multimeerseid valgukomplekse TIM ja TOM. Mitokondri valgud ja genoom Tuumas asuv DNA kodeerib suure osa Mitokondriaalne DNA on endosümbioosi tõttu sarnane prokarüootidega, struktuur on rõngasjas. Ühes mitokondri geene
Konjugatsioonil osa kromosoomist ja osa F-plasmiidist kantakse üle retsipiendile Transformatsioon Organismi geneetiline muutumine võõr-DNA rakku sisenemise tagajärjel. Nt. Lüüsunud raku kromosoomi fragmendid võetakse retsipientraku poolt vastu, kus see siis liidetakse viimase geneetilisse materjali Doonor – ja retsipientrakud ei pea olema seotud Annab hea võimaluse DNAga manipuleerimiseks ja valkude ekspressiooniks Transduktsioon Bakteriodaagide vahendusel geneetilise informatsiooni kandumine ühelt bakterirakult teisele Kaks tüüpi: Üldine transduktsioon – doonirrakust retsipient võidakse üle kanda suvaline bakterigeen Spetsialiseeritud transduktsioon – doonorrakust kantakse retsipientrakku üle geene vaid kromosoomi kindlast (lühikesest) piirkonnast 8. Valgusünteesi regulatsioon Geenid on aktiivsed vaid siis, kui nende produkte läheb vaja
(ca 15-20 ml ühele tassile). Liiga kuumas (>60 oC) söötmes antibiootikum laguneb! Tassid tarduvad ~15 min pärast. Iga üliõpilane saab ühe Petri tassi ja kirjutab oma nime plaadi äärde (sellele poolele, kus on agar). (7) Transformeeritud rakkude külvamine Petri tassidele: Transformeeritud rakkude tuubi lisa 10 l IPTG ja 10 l X-gali lahust, sega korralikult, kuid ära tsentrifuugi! Nende substraatide lisamine on vajalik beta-galaktosidaasi ekspressiooniks, mis võimaldab identifitseerida bakteri kolooniad, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid). (8) Saadud segu (230 l) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka. Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega. (9) Paiguta saadud tassid ümberpööratult 37 oC inkubaatorisse. Kolooniate värvusreaktsioon (sinine/valge) ilmneb 12-20 h pärast
Tassid tarduvad ~15 min pärast. Iga üliõpilane saab ühe Petri tassi ja kirjutab oma nime plaadi äärde (sellele poolele, kus on agar). Nime tuleb kirjutada plaadi äärde, selleks et edasi oleks võimalik eristada sinised ja valged kolooniad. (7) Transformeeritud rakkude külvamine Petri tassidele: Transformeeritud rakkude tuubi lisa 10 l IPTG ja 10 l X-gali lahust, sega korralikult, kuid ära tsentrifuugi! Nende substraatide lisamine on vajalik beta-galaktosidaasi ekspressiooniks, mis võimaldab identifitseerida bakteri kolooniad, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid). (8) Saadud segu (230 l) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka. Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega. (9) Paiguta saadud tassid ümberpööratult 37 oC inkubaatorisse. Kolooniate värvusreaktsioon (sinine/valge) ilmneb 12-20 h pärast
73. Plasmiidse DNA edasine kasutus 74. Olenevalt sellest, millisteks katseteks uuritavat järjestust vaja on, toimub edasine kloneerimine. Kui tegu on valku kodeeriva DNA järjestusega, mida soovitakse ekspresseerida mõnes eukarüootses rakus või rakuliinis, siis tõstetakse lihtsasse bakteriaalsesse kloneerimisvektorisse sisestatud järjestus edasi mõnda ekspressiooni vektorisse. Selline vektor sisaldab vajalikke järjestusi valgu ekspressiooniks rakkudes, aga ka bakteris paljundamist võimaldavaid elemente, kuid millesse kloneerimine otse PCR-ist oleks liiga tülikas. Seega restrikteeritakse esialgsest bakteriaalsest vektorist soovitud järjestus uuesti välja ja ligeeritakse samade restriktaasidega lõigatud ekspressioonivektori MCS-i. Uut konstrukti paljundatakse jällegi algul bakterites ja puhastatakse välja suurem kogus DNA-d. 75. 76.
nende t-retseptorite ümber organiseerumine. Tümotsüüdid on suuremad kui küpsed T-rakud ja prolifereeruvad aktiivselt. (Varaste tümotsüütide eellaste puhul: kui rakud edukalt reorganiseerivad oma TCR-b lookuse ning ekspresseerivad funktsioneeriva eel-TCR- kompleksi, siis nad paljunevad kiiresti ja teevad läbi edasise diferentseerumise ekspresseerides ko-retseptoreid CD4 ja CD8. Signaalid kantakse üle eel-T retseptorite raku proliferatsiooniks ja CD4/CD8 ekspressiooniks (DP)) Aktiivset proliferatsiooni aitavad stimuleerida mitte lümfoidsed tüümuserakud, mis sekreteerivad tsütokiini. ja ahelate geenide ümberkorraldused, on vajalik RAG-1 ja RAG-2 valkude aktiivsust. Pärast proliferatsiooni, pääsevad rakud edasi tüümuse korteksisse. Seal interakteeruvad nad tüümuse struuma rakkudega, makrofaagid ja dendriitrakud ekspresseerivad MHC I ja MHC II molekule oma rakkude pinnal, aitavad läbi viia selektsiooni.
3. signaali (IL2-IL2R) annab T- rakk endale ise. Kui blokeerida 2. signaal (CD28-B7 seondumine) siis T- raku aktivatsiooni ei järgne. T- rakk muutub "anergseks" - mitte reageerivaks, immuunsüsteemile kasutuks. T- rakud sisenevad lümfisõlmedesse spetsiaalsete endoteelirakkude (HEV) kaudu ja moodustavad seal APC-dega kontakte. Edasine TCR ja MHC interaktsioon viib TCR kompleksiga seotud CD3 rakusiseste domeenide (ITAM) fosforüülimisele. CD3 on vajalik TCR membraani ekspressiooniks ja signaaliülekandeks (peale TCR-ag-MHC seondumist). Lck poolt fosforüülitud türosiinid on võimelised enda külge siduma teisi kinaase, mis omakorda fosforüülivad lähedal olevaid signaaliülekannet vahendavaid valke. Aktiveerub biokeemiline kaskaad, mis võimaldab signaali liikumist membraani pinnal ja sealt edasi tsütosooli ning sealt omakorda rakutuuma (NFkB). TCR-i interaktsioon MHC-ga ei ole võimeline aktiveerima T- rakku,
aminohapete metabolismiga. Lrp abil reguleeritakse ka rakkude sisenemist statsionaarsesse kasvufaasi. Siiani pole ühtegi konkreetset hüpoteesi, miks bakterid peaks leutsiini hulga kaudu tunnetama rakkude üldist nälga. Valkude süntees ja kasv Üks metabolismi lõppsaadus on aminohapetest valkude assambleerimine. Eksponentsiaalses kasvufaasis, kui bakterid kasvavad kiiresti, on umbes 75% rakkude transkriptsioonist suunatud ribosoomide ekspressiooniks. Selleks, et sünteesida valke, tunnetab bakter rakus olevat energiataset ning aminohapete kättesaadavust. ATP ja GTP kontsentratsioon mõjutavad otseselt rRNA geenide transkriptsiooni. Mõlemad nukleotiidid on transkriptsiooni initsiatsiooni esimesed nukleotiidid, mis RNA ahelasse lülitatakse. Initsieeriva nukleotiidi defitsiit langetab ka rRNA geenide transkriptsiooni ning rakkude kasvukiirust. ATP hulga kaudu reguleeritakse rakkude kasvu ka kaudselt. ATP
suuremad kui küpsed T rakud ja prolifereeruvad aktiivselt. Varaste tümotsüütide eellaste puhul: kui rakud edukalt reorganiseerivad oma TCR- (T- cell antigen receptor) lookuse ning ekspresseerivad funktsioneeriva eel- TCR- kompleksi, siis nad paljunevad kiiresti ja teevad läbi edasise diferentseerumise ekspresseerides ko- retseptoried CD4 ja CD8. Signaalid kantakse üle eel-T retseptorite raku proliferatsiooniks ja CD4/CD8 ekspressiooniks (DP double positive). Aktiivset proliferatsiooni aitavad stimuleerida mitte lümfoidsed tüümuserakud, mis sekreteerivad tsütokiini. ja ahelate geenide ümberkorraldused, on vajalik RAG-1 j a RAG-2 valkude aktiivsust. Pärast proliferatsiooni, pääsevad rakud edasi tüümuse korteksisse. Seal interakteeruvad nad tüümuse struuma rakkudega, k.a. epiteelrakud, makrofaagid ja dendriitrakud ekspresseerivad MHC I ja MHC II molekule oma rakkude pinnal, aitavad läbi viia selektsiooni
Esimene piirkond amfiimne, mille külge kinnitub RNA polümeraas. Iga rna tegemiseks peab olema oma tRNA. Terminatsioonis on oluline konfiguratsiooni moodustamine, mis moodustub vastavalt sellele milline on lineaarne geenistruktuur. Ühel kohal tekib kaksikahel. Sekundaarne ja tertsiaalne struktuur tuleneb eelkõige nende primaarsest ahelast. Analoogne on ka valgu korral. Valku kodeerivate geenide transkriptsioon RNA II polümeraasiga : Transkriptsiooni produkt mRNA. Vajalik promootor ekspressiooniks. Põhielement (start, ~-25 bp) "TATA Box" = TATAAAA. Proksimaalne element ( ~-50 to -200 bp) "Cat Box" = CAAT and "GC Box" GGGCGG. Eri kombinatsioonid eri geenide promootorites. RNA peab olema lõpetatud molekul, muidu ta ei ole stabiilne. Lõppu pandakse mitte... järjestused. RNA polümeraas II Transkriptsioonifaktor sama mis sigma prokarüoodil;kõik RNA polümeraasid vajavad. TFid on valgud, mis formeeruvad promootori basaalelemendil. Iga TF töötab vaid oma RNA
transkriptsiooniühikute vahel, s.t. geenid paiknevad peamiselt kromatiinsetel lingudel. Transgeensetel loomadel on näidatud, et SARsid on vajalikud teatud naabergeenide ekspressiooniks. Äädikakärbsel on demonstreeritud, et mõned SARsid eraldavad transkriptsiooniühikud teineteisest, nii et ühe geeni transkriptsioonis osalevad valgud ei mõjuta naabergeene, mis on eraldatud SAR-iga. 36. Kuidas tuvastada transkriptsiooniregulaatorite märklaud geene? Muteerides uuritavat transkriptsiooni regulaatorit (selle leidmiseks võib kasutada nt DNase I footprintingut, mis näitab valgu asukohta (valk DNA-l, hakatakse lõikama lühikesi juppe, märgistatud 32P-ga) ja EMSA-ga saab
Transkriptsiooni stimuleerivad nõrgad happed (atsetaat, bensoaat) ning rakkude viimine rikkalt söötmelt vaesele (tagab 10-kordse transkriptsiooni tõusu). 2. Translatsioon. rpoS mRNA moodustab sekundaarstruktuuri, mis takistab mRNA transleerimist. Selleks, et mRNA muutuks transleeritavaks, peab temaga seonduma RNA shaperon Hfq (varem tuntud nimetuse all Host Factor I, HF-I osalust on näidatud veel RNA faagi Q replikatsioonil). S ekspressiooniks madalal temperatuuril kasvavates eksponentsiaalse kasvufaasi rakkudes on vajalik väike RNA molekul dsrA, mis muudab rpoS mRNA transleeritavaks madalal temperatuuril. Arvatakse, et H-NS-i negatiivne mõju S-i ekspressioonile on samuti seletatav rpoS mRNA sekundaarstruktuuri kontrolliga. H-NS soodustab sellise rpoS mRNA sekundaarstruktuuri teket, mis takistab translatsiooni. 3. Valgu stabiilsus. S stabiilsust bakterirakus kontrollivad ClpXP proteaas ja RssB. RssB eksponeerib
annaabi.ee 
