Jälgin et lahus saaks homogeenseks Tsentrifuugin Jätan üleöö ligeerima +4 kraadi juurde. Millise konstrukti oma töö käigus kloneerisin? Ligeerisin sellise konstrukti, kus bSTBlue-1 vektoris EcoRV saidis on minu insert ehk DST geen. Milleks kasutasime kloneerimisel pSTBlue-1 vektorit? Mis teeb selle eriliseks? See on meie vahevektor ja see on väga hea kuna võimaldab sini-valge skriinimist ja seal on mõlemal pool EcoRV saiti EcoRI sait, ehk seda oli väga lihtne restriktaasidega lõigata. Kas sini-valge selektsiooni kasutamisel võib õige koloonia olla ka sinine? Miks? Vahel ikka juhtub. Insert võib olla väga väike, seega lacZ jääb terveks ja koloonia värvub ikkagi siniseks. Kui tahame 5kb suurusesse vektorisse ligeerida 1000bp pikkust inserti, siis kui palju vektorit peame 50ng inserdi kohta võtma? Soovitud vektori:inserdi suhe on 1:5. Vektor : 5000bp Insert: 1000bp
6. Kontroll-restriktsioon a. Kontroll-restriktsiooni on vaja, et kontrollida, kas saadud plasmiid on õige, see võimaldab ka näha, kas puhastamine oli efektiivne foreesipildilt on näha, kui proovis on lisaks saadud plasmiidile ka näiteks bakteriaalset DNA-d. Valides sobivad restriktaasid, on võimalik kontrollida, kas insert on plasmiidi sisenenud õiget pidi. b. Kasutasime restriktaasi EcoRI, mis lõikab kahelt poolt EcoRV lõikamissaiti, kuhu sisestasime oma inserdi. See võimaldab tükkide pikkuste järgi määrata, kas insert on vektorisse sisenenud või mitte. Protokoll: 1. Pipeteerida: i. 5,9 l vett ii. 3 l just puhastatud plasmiidset DNA-d iii. 1 l restriktaasi 10x puhvrit iv. 0,1 l EcoRI restriktaasi (hoida külmas!) 2. Segada, fuugida ja inkubeerida 37oC 30 min 3
puudub Restriktsiooni endonukleaasid Restriktaasid Järjestusspetsiifilised DNA endonukleaasid Produtseeritakse erinevate bakterite poolt selleks, et degradeerida ehk restrikteerida võõr DNA molekule Peremeesraku DNA on kaitstud tänu lämmastikaluste spetsiifilisele metülatsioonile Isoleeritud ja biokeemiliselt iseloomustatud on sadu restriktaase Nomenklatuur tähis tuletatakse isoleerimiseks kasutatud liigi nimest EcoRI E. coli tüvest R isoleeritud esimene restriktaas Restriktaasid Enamus restriktaase on kaksikahelalise DNA spetsiifilised Erinevate restriktaaside hüdrolüüsi tulemusena tekkivad molekulide otsad võivad olla erinevate "etteulatuvate" ahelatega Restriktaasid on endo(I) tüüpi nukleaasid DNA fragmentide katalüütiline HaeIII 5´...GGCC... 3´ fragmenteerimine leiab laialdaselt 3´.
Restriktaasid – endonukleaasid, mis fragmenteerivad DNA-d spetsiifilistest kohtadest Metülaasid – modifitseerivad nukleotiide restriktaaside poolt äratuntavatest 4 – 6 bp pikkustest DNA järjestustest, kaitstes DNA-d restriktaasi eest Rakus lagundatakse võõrast DNA-d, mis ei ole antud bakteritüve restriktaasi eest kaitstud E. coli tüves RI on kirjeldatud restriktaas EcoRI ja sellele vastav metülaas, mis metüleerib adeniini restriktaasi poolt äratuntavast järjestusest GAATTC Bakterifaagi DNA modifitseerimine Vahetult pärast faagi varajaste geenide avaldumist lagundatakse bakteri DNA faagi poolt kodeeritud endonukleaaside abil
toimus G->T]; · IVS7-3(C->T) [7. introni -3 positsioonis C->T] · deletsioonid, insertsioonid: · 2632(del5) [sealt 5 nukleotiidi deleteerunud] · 364(ins4) [sinna toimund 4 nukleotiidi insertsioon] 15. "Suurte" geenmutatsioonide tuvastamise meetodid Suured on üle 1000 aluspaarilised deletsioonid ja duplikatsioonid, tuvastatakse kas tsütogeensete meetoditega või: Southern Blot: Näide: kadunud on üks EcoRI restriktsioonisait. Paneme koos normaalse geeniga kokku, lisame EcoRI, mis lõikab kõik juppideks. Lisame fosforiga märgistatud sondi, mis hübridiseerub EcoRI restriktsioonisaidiga. Geelil tuleb välja, sond hübridiseerus erinevate bändidega. [kahtlen sügavalt teksti õiguses] dHPLC denatureeriv kõrgsurve vedelikkromatograafia. Normaalne kõrgsurve kromatograafia denaturatsioonikolonniga. Kolonn lahutab produkte. Hetero- ja homodupleksid tulevad erineval ajal läbi kolonni, sest denatureeriv mõju neile on erinev
Omaenese restriktaaside suhtes on bakterid resistentsed, sest bakteri enda genoomis on need järjestused kaitstud adeniini ja tsütosiini jääkide metüleerimisega. Paljude restriktaasidega lõikamise tulemusel tekivad DNA fragmendid, mille otstes on lühikesed, 2 4 nukleotiidi pikkused üheahelalised alad. Neid nimetatakse kohesiivseteks e kleepuvateks otsteks, kuna nad võivad paarduda teiste sama restriktaasiga lõigatud DNA üleulatuvate otstega. Mõned restriktaasid tekitavad 5' (EcoRI), teised 3' (PstI) üleulatuva otsaga fragmente. On ka restriktaase, mis tekitavad tömpotsalisi fragmente (SmaI). 44. DNA kloneerimise etapid. bläblä 45. DNA sekveneerimise põhimõte. Erinevad DNA molekulid liiguvad erineva kiirusega ja siis mingi lahe süsteem oli. http://www.biotech.ebc.ee/praktikum/juhend3.html 46. Polümeraasi ahelreaktsioon. Äö, praimerid ja värk! Pannakse vajalik(?) jama lahusesse ja imeväel toimub DNA kloneerimine. 47. Kromatograafia.
järjestustest ning neid nim. ka restriktsiooni kohtadeks. Looduses kasutavad bakterid restriktsiooniensüüme kaitseks neid nakatavate bakteriofaagide eest. Bakteriofaagi sisenedes bakteri rakku restsiktsiooniensüümid lõikavad viiruse DNA mittefunktsionaalseteks väikesteks tükkideks ning päästavad bakteri infektsioonist. 10. Milliseid tüüpe restriktsiooniensüüme te teate ja millised on nende toimimise mehhanismid? Esimeseks restriktsiooniensüümide alamtüübi esindajaks on EcoRI, mis lõikab DNA'd kahest ahelast erinevast positsioonist mille tagajärjel on saadud DNA fragmendil kleepuvad otsad ning need võimaldavad vesiniksideme teket neile komplementaarse järjestusega. Erinevatest allikatest ja organismidest pärit selliseid DNA fragmente saab kasutada rekombinantse DNA molekuli loomiseks. Teise alamtüübi esindajateks on nt HindII ja SmaI (Serratia marcescens), mis lõikavad DNA läbi mõlemast ahelast täpselt samast kohast mille tagatärjeks on tömbid DNA otsad
Iseloomustage järgmiste ensüümide toimet (kirjeldage katalüüsitavaid reaktsioone). Vajadusel illustreeriga vastust joonise või skeemi abil. a) Endonukleaas Rnaas A endonukleaasid hüdrolüüsivad nukleiinhapete sisemisi fosfodiestersidemeid. Powerpoindist võetud tabel: Ahelate lõikamise loogika üldiselt: Alguses: Peale hüdrolüüsimist: a - fosfodiestersideme 3' pool; b - fosfodiestersideme 5'-pool b) Restriktaas EcoRI (,,kleepuvaid" otsi produtseeriv endonukleaas) restriktaas ehk restriktsiooniensüüm kaitseb bakterit võõra DNA sissetungi eest. II ja III tüüpi restriktaasid lõikavad DNA ahelaid kindlates kohtades Ei vaja ATP. Kaheahelalise DNA restriktaaside äratundmissaitidel on 2-kordne sümmeetriatelg. Sõna EcoRI tuleb E. coli (soolekepike) R liinis avastatud esimene restriktaas. c) DNA polümeraas ensüümid, mis viivad läbi DNA
BfaI c|tag none BfrI c|ttaag none BfrBI atg|cat none BglII a|gatct none BlnI c|ctagg none BseCI at|cgat 980 BsePI g|cgcgc none BseX3I c|ggccg none BshTI a|ccggt 662 Bsp1407I t|gtaca 168 Bsp19I c|catgg none BspDI at|cgat 980 BspEI t|ccgga none BsrGI t|gtaca 168 BssHII g|cgcgc none BstUI cg|cg 114, 361, 482, 933 ClaI at|cgat 980 DraI ttt|aaa none EagI c|ggccg none EcoRI g|aattc none EcoRV gat|atc 200, 703 EgeI ggc|gcc none FseI ggccgg|cc none FspI tgc|gca 15, 372, 567 HaeIII gg|cc 599 HincII gty|rac 220, 333 HindIII a|agctt none HinfI g|antc 521, 952 HpaI gtt|aac none HpaII c|cgg 93, 177, 215, 243, 663, 867 KasI g|gcgcc none KpnI ggtac|c none MboI |gatc 303, 436, 769, 808 MfeI c|aattg none MluI a|cgcgt none MscI tgg|cca none MseI t|taa 399, 621, 750, 1005
järjestus on plasmiidi sisestunud. Valitakse selliseid restriktaase, mis lõikavad nii inserdi kui vektori enda seest ning seejuures veel niimodi, et tekuksud erineva pikkusega jupid, mille suurust oleks hea võimalikult täpselt kasutatava DNA Ladderiga võrreldes kontrollida. 1. Kontroll-restriktsiooni teostamiseks esmalt pipeteerisin kokku 5,5 μl vett, 3 μl puhastatud DNA-d, 1 μl restriktaasi 10x puhvrit, 0,5 μl EcoRI restriktaasi, fuugisin ja inkubeerisin 37 °C 30 min jooksul 2. Kui 30 min on täis, fuugisin uuesti, kuna sooendamisel kaanele kondenseerus veeaur. Lisasin 2 μl 6x DNA värvi 3. Elektroforeesiks valasime 100 ml TAE geeli (1%) 4. Pipeteerisin kogu oma segu agaroosgeeli hambasse. 5. Tehtud pildist oli arusaadav, et ma ei saanud õige kõrgusega bändi. Nagu selgus, viga oli bakterite kasvamisel ja meil kasvanud bakterite kolooniad polnud tegelikult õiged. Võib olla
DNA lõikamine restriktaasidega DNA kloonimine DNA sekveneerimine – nukleotiidse järjestuse määramine Insenerigeneetika – DNA järjestuse muutmine ja GMO-de loomine – muudetud geneetilise materjali viimine organismidesse. 3. Mis on restriktaasid? Endonukleaasid, mis lõikavad DNA-d kindlatest kohtadest (äratundmisjärjestustest – ÄJ). ÄJ on 4-8 bp pikkune DNA järjestus. Kui restriktaasid lõikavad, siis võib tekkida kas EcoRI-ga kleepuvad otsad, millega on lihtsam DNA-d uude kohta ühendada (üleulatuvad) või tömbid otsad SmaI-ga. Igal restriktaasil on oma kindel äratundmisjärjestus. 4. DNA kloonimine, millised on isepaljunevad süsteemid DNA kloonimiseks. DNA kloonimine on teatud DNA lõigu paljundamine. Selleks kasutatakse kas isepaljunevaid süsteeme või PCRi. Isepaljunevad süsteemid – vektorid on kas bakterite plasmiidid või viirusvektorid (viib soovitud geeni rakku). 5
● PCR puhver + vesi – keskkond reaktsiooni läbi viimiseks. 137. Restriktaasid, nende funktsioon bakterites ja nende kasutus DNA analüüsimisel Tegemist on bakteriaalset päritolu ensüümidega, mis on bakterites oluliseks viirusvastaseks kaitsemehhanismiks. Restriktaasid tunnevad ära kindlaid DNA järjestusi ja järjestusega seondumise järel lõikavad DNA ahela katki. Näiteks tunneb tuntumaid sedalaadi ensüüme EcorI DNA ahelas spetsiifiliselt ära järjestuse GAATTC, seondub ning lõikab DNA G ja A nukleotiidide vahelt katki. Kuna DNA koosneb kõigis organismides samadest nukleotiididest, on restriktaase võimalik kasutada ka imetajate genoomi analüüsimiseks. Restriktaasiga töödeldud DNA ahelast tekkinud erineva pikkusega fragmendid lahutatakse teineteisest geelelektroforeesi (vt allpool) abil. Sel moel on võimalik teha indiviiditi kindlaks, kas vaadeldud piirkonnas esineb indiviidide vahel erinevusi
annaabi.ee 
