SDS-i 10% lahus – 50 µl Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8% lahus – 0,67 ml Polümerisatsioonireaktsiooni katalüseerimiseks: TEMED – 4 µl tõmbekapi all APS – 40 µl 4. Valasime kontsentreeriva geeli lahutava geeli peale, eelnevalt kontrollides lahutava geeli polümeseerimist, ning ettevaatlikult panime paika kammi. Jätsime geel polümeriseeruma. Vlaguproovide valmistamine: 1. Segasime omavahel valgulahus ja 2x laadimispuhver, mille komponendiks on broomfenoolsinine – värv, mis aitab jälgida proovide migreerumist (15 µl valgulahus + 15 µl laadimispuhvri) eppendorfis. 1. Trüpsin 23,8 kDa 2. EPGluC 29 kDa 3. Laktaat dehüdrogenaas 35 kDa 4. HRP 44 kDa 5. Ovalbumiin 44,3 kDa 6
g. > 0.1% SDS and > 1% Triton series) või rakulised lipiidid, mis suurendavad CBBG lahuse absorbtsiooni 590 nm juures. CBBG seostub tugevasti kvartsküvettide seintele, mistõttu on soovitav kasutada klaas või plastikküvette. Reaktiivid Terve grupi peale: · 5x Bradfordi reagendi varulahus (0,01% (w/v) CBBG, 4,75% (v/v) etanool, 8,5 % (v/v) fosforhape) Iga väikse grupi peale: · 200 µl 1 mg/ml BSA lahus · 200 µl 5M NaOH · mQ vesi · 100 µl uuritav valgulahus proov nr Töö käik 1. Bradfordi reagent: Lahusta 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 50 ml 95% ethanoolis, lisa 100 ml 85% (w/v) fosforhapet. Kui reagent on täielikult lahustunud, lahjenda 1 liitrini ja filtreeri lahus läbi Whatman #1 paberfiltri. Reagent peab olema värvuselt pruun. Korduv filtreerimine aitab eemaldada sinist komponenti. Külmas säilitatuna on reagent väga stabiilne (1 aasta). 2
hapete, leeliste või ensüümide mõjul reageerivad veega, mille tõttu katkevad peptiidsidemed ning reaktsiooni lõppsaadusena tekivad aminohapped valgud on amfoteersed valkude kindlaksmääraamiseks kasutatakse: a) söestumisproovi (nt. küüne põlemine) kuumutamisel valkained söestuvad ja eritavad iseloomulikku lõhna b) ksantoproteiini reaktsioon valgulahus c) biureedireaktsioon eelistatule valgulahusele lisatakse vasksulfaadilahus 10. Funktsioonid: 1) Struktuurne f. 2) Mehhaanilis-keemiline f. lihastes on 2 võimalust: sirutus, kokkutõmme 3) Katalüütiline f. biokatalüsaatorid (ensüümid) reguleerivad organismis toimuvaid keemilisi reaktsioone 4) Regulatoorne f. sisenõrenäärmete poolt sünteesitakse valgulise iseloomuga hormoone.
pH > pI – negatiivselt laetud Happelised aminohapped annavad valgule happelised omadused ja aluselised vastavalt aluselised omadused. Vt aminohapped. 8. Füüsikalis-keemilised omadused Kolloid-osmootsus e onkootsus(osmootne rõhk kolloidlahuses)[enamik valke on hüdrofiilsed ja vesilahustuvad. Kollageenid ei lahustu vees ahelatevaheliste sidemete tõttu, kuid punduvad (seovad rohkesti vett). Tõelised (molekulaarsed) lahused. Püsivus – valgulahus ei koaguleeru seismisel (ei sadene täielikult). Väike difusioonikiirus – lahustunud aine molekulide liikumine lahuses madalama konsentratsiooni suunas tasakaalu saabumiseni, st lahustunud aine molekulide ühtlase jaotumiseni lahuses. Madal osmootne rõhk – valgud ei läbi biomembraane. Kõrge viskoossus – võime moodustada soole ja geele. Optilised eriomadused – valgulahus hajutab/peegeldab valgust]; amfoteersus; puhverdusvõime; opt aktiivsus ja
pH > pI negatiivselt laetud Isoelektriline punkt pH väärtus, mille juures ei ole summarset laengut e laeng on 0 (anioonid=katioonid). 8. Valgu Füüsikalis-keemilised omadused Kolloid-osmootsus e. onkootsus (osmootne rõhk kolloidlahuses), enamik valke on hüdrofiilsed ja vesilahustuvad. Kollageenid ei lahustu vees ahelatevaheliste sidemete tõttu, kuid punduvad (seovad rohkesti vett). Valgulahused- Tõelised (molekulaarsed) lahused. Püsivus valgulahus ei koaguleeru seismisel (ei sadene täielikult). 2 Väike difusioonikiirus lahustunud aine molekulide liikumine lahuses madalama konsentratsiooni suunas tasakaalu saabumiseni, st lahustunud aine molekulide ühtlase jaotumiseni lahuses. Madal osmootne rõhk valgud ei läbi biomembraane. Kõrge viskoossus võime moodustada soole ja geele. Optilised
7. Valgumolekulide aluselised ja happelised omadused. Valkude isoelektriline täpp. Valgud on amfoteersed polüelektrolüüdid võivad liita või loovutada H+ iooni. Neil on kindel pI väärtus. Mida suurem on suhe happelised/aluselised, seda madalam on valgu pI. Valgu isoelektriline täpp pI keskonna pH, mille korral valgu molekuli summaarne laeng on null(anioonsed laengud=katioonsed laengud), valgud sadenevad kõige kergemini, valgulahus on kõige ebastabiilsem. 8. Valkude füüsilis-keemilised omadused. (lk. 64) 1. Valkudel on laeng: COO NH3+ (see ei anna laengut!) C terminaalne ots N terminaalne ots Laeng on põhjustatud koostises olevate AH radikaalide laengutest. Laeng kindlustab vaba liikumise elektriväljas ja tagab stabiliseeruva H2O molekulkihi ümber valgu, seega ka valkude lahustuvuse. Kui summaarne laeng on 0, sadeneb kergesti välja. 2. Lahustuvus veres ja veresoola lahustes
prootoni aksteptoritena (lahus on nõrk alus). Füsioloogilise pH (7-7,4) juures on aminorühm protoneeritud ja karboksüülrühm karboksülaataniooni vormis. (need on laenguga, st molekulid on bipolaarsed ioonid) Lahused on nõrgad puhvrid. Happelises keskkonnas on aminohapped katioonid, aluselises keskkonnas on anioonid. Isoelektriline täpp pI on keskkonna pH, mille korral on valgu molekuli summaarne laeng null. Selle juures valgud sadenevad kõige kergemini, valgulahus on kõige ebastabiilsem. Aminohapped elektriväljas ei liigu, on elektriliselt neutraalne, anioonsed ja katioonsed laengud on võrdsed. pH < pI positiivselt laetud pH > pI negatiivselt laetud pI isoelektriline täpp pH vesinikeksponent pK dissotsiatsioonikonstant 8. Valkude füüsikalis-keemilised omadused Laeng: COO NH3+ (see ei anna laengut!) C terminaalne ots N terminaalne ots Laeng on põhjustatud koostises olevate AH radikaalide laengutest. Laeng kindlustab vaba liikumise
Standardlahuse lahjendamisel saadakse rida teatud kontsentratsiooniga lahuseid. Selles töös mõõdetakse lahjendusterea lahuste ekstinktsioonid, konstrueeritakse standardgraafik ja selle abil leitakse valgu kontsentratsioon uuritavas lahuses. Töövahendid • Statiiv ja plastviaalid • klaasviaal reaktiiv C valmistamiseks • automaatpipetid • mikser • spektrofotomeeter Uuritav lahus: Tundmatu kontsentratsiooniga valgulahus Standardlahus ja kasutatavad reaktiivid 1. Valgu standardlahus: albumiinilahus, milles üldvalgu kontsentratsioon on 320 µg/ml (lahus on valmis). 2. Reaktiiv A: 2% Na2CO3 lahus 0,1 M NaOH-s (lahus on valmis). 3. Reaktiiv B: 0,5% CuSO4 . 5 H2O lahus 1% K-tsitraadis (lahus on valmis) 4. Folin-Ciocalteau reaktiiv Üliõpilasel valmistada 5. Reaktiiv C: Reaktiiv C on ebapüsiv, seetõttu tuleb ta valmistada ex tempore. Segage reaktiivid A ja B vahekorras 50:1
saame jälgida valgu preparatsiooni puhtust. Kui puhastame valgu, siis saame erinevate etappide järgi määrata valgu kontsi lahuses ja selle järgi määrata eriaktiivsust ja seda kõrvutades puhta valgu eriaktiivsusega, siis saame puhtuse % ehk puhtuse astme. Ntx: 100kDa on 100 000g/mol=100 000 mg/mmol=100mg/umol Q Sefaroosi maatriks, mis kannab pos laengut, anioonvahetus. Sefakrüül on suuruse järgi lahutamine. Geelfiltratsiooni miinuseks on see, et ruumala läheb suuremaks, valgulahus lahjeneb see on alati negatiivne. Valku tahetakse saada ikka kontsentreeritult. Valgu puhastamisel mida rohkem etappe, mida vaja teha, seda halvem, sest vigu võib teha rohkem. Ioonvahetuseks peab olema valk õiges puhvris (samas, millega kolonn on tasakaalustatud). Iga ioonvahetuse ette käib puhvrivahetus. Suuruse järgi lahutamiseks on vajalik, et lahused oleks kontsentreeritud vms. Ensüümkineetika mõõtmine 20
annaabi.ee 
