Lahus 3 sisaldab KOAc (kaaliumoksaalatsetaat). See neutraliseerib lahust ja lubab plasmiidse DNA renatureerimise ja KOAc aitab sadestada detergendi (SDS). Kuna viiruse genoom on väiksem, siis renatureerub ta kiiremini kui bakteri 4Mb suurune kromosoom. Kromosoom ei jõua kaheahelaliseks minna. 10. Miks RNA töötlus? RNaasi töötlus aitab veelgi puhtamaks saada puhastatavat DNA lahust. RNaas lagundab RNA rakkudes. 11. Millist tüüpi restriktaase kasutame? tüüp 2 - lõike- ja seondumissait kattuvad. Lõikavad vaid dsDNA-d (ainult ds lineariseerub, ss jääb tsirkulaarseks - tsirkulaarne jookseb geelil kiiremini - saab neid eristada). Tunneb ära 6-nukleotiidilise järjestuse GAATTC. Vajab tööks Mg ++. Lõigatud otsad jäävad üheahelaliseks (aka. kleepuvad otsad). 12. Miks ei või geeli vette teha vaid peab puhvrisse panema? Agaroosgeel peab olema tehtud puhvrisse, sest kui seda jooksutada ka puhvris ja kui geel on tehtud vette, siis Tris puhver tõmbab geelist vee välja
CD4+ lümfotsüüdid ehk T4 rakud ehk helper-rakud T4 lümfotsüüdid ehk helper-rakud tunnevad ära antigeeni koos MCH II kompleksiga T8 lümfotsüüdid vahendavad TCR ja MCH I seondumist T-lümfotsüüdid tunnevad antigeeni ära ainult seoses MHC kompleksiga Antikehad on peaaegu eranditult efektiivsed ainult väljaspool rakku. BCR ja TCR tehakse valmis enne kui rakk kohtub antigeeniga B-raku pinnal on tuhandeid identseid BCR koopiaid BCR-il on üks seondumissait epitoobile Lümfokiinid on tsütokiinid. TH1 ehk T41 - soodustavad eeskätt immuunvastust rakusiseste patogeenide ja seente vastu TH2 ehk T42– vastutavad antikehade tootmise ja immunoloogilise mälu eest Kuidas nimetatakse mononukleaarseid fagotsüüte veres ja kuidas kudedes? – veres monotsüütideks, kudedes makrofaagideks Mis on mononukleaarsete fagotsüütide ülesanded (nimeta 2)? – osalevad loomuliku resistentsuse kujunemisel, esitlev funktsioon
olemas, siis teiste süsinikuallikate (näiteks laktoosi) kasutamiseks vajalike valkude transkriptsioon on alla surutud. Trüptofaani süntees-Kui rakus kättesaadav trüptofaan saab otsa, siis trüptofaan eraldub repressormolekuli küljest ning rakk hakkab taas trüptofaani sünteesima. Transkriptsiooni järgne kontroll 5´ cap-saidi lisamine pre-mRNA 5´ otsa. Vajalik translatsiooni alustamiseks- võimaldab ribosoomi subühikul leida üle seondumissait mRNA-ga ja seostuda. Splaising- pre-mRNA koostisest lõigatakse välja intronid ja ühendatakse omavahel eksonid. Toimub splaisosoomides, raku tuumas. Seega on võimalik ühelt geenilt toota mitu erinevat mRNA-d, valku. Polüadenüleerimissaidi (3´poly A-saba) lisamine pre-mRNA 3´ otsa. Toimub transkriptsiooni ajal või lõpus. Vajalik mRNA molekuli väljumiseks tuumast läbi pooride ja stabiilsuse tagamine tsütoplasmas.
Initsiatsiooniks on vajalik: 30S ja 50S sübühikut mRNA fMet- tRNA GTP Initsiatsioonifaktorid IF1- blokeerib ribosoomi A-saidi, hoiab selle vabana ja võimaldab fMet-tRNA-l seonduda ainult P saiti. IF3- blokeerib E-saidi ja takistab ribosoomi subühikute omavahelist asotsiatsiooni. IF4- väike GTP-ase, mis seondub fMet- tRNAga ja aitab sellel seonduda 30S subühikuga. - 16s rRNA tunneb oma 3’ otsaga ära RBS elemendi (ribosoomi seondumissait, Shine-Dalgarno järjestus) mis asub 5 -10 b ülapool initsiaatorkoodonit: see paigutab p-saidi initsiaatorkoodoni kohale. - fMet- tRNA seondub paardulise abil initsiaatorkoodonile. - Seondub 50S subühik. Prokarüootne translatsioon ELONGATSIOON algab A-saidi vabanemisega, mis võimaldab uute aa-tRNA-de seondumist. Selles osaleb elongatsioonifaktor Tu (EF-Tu; väike GTP-ase). Toimub peptiidsideme moodustamine ja translokalisatsioon : ribosoom liigub 3 nukleotiidi
sünteesitud oligonukleotiide, mis kinnituvad DNA erinevatele piirkondadele ning milled vahel sünteesitakse korduvalt samapikkuselisi DNA- lõike. Praimerid on alati paarikaupa, st seonduvad erinevate DNA- ahelatega. Esimeses tsüklis sünteesitakse lähtuvalt praimeritest nn pikad DNA- lõigud, mis ületavad teise vastaspraimeri seondumissaite. Teises tsüklis seondub teine vastaspraimer juba sünteesitud DNA-ahelale ning selle ahela teine ots on esimese praimeri seondumissait. Järelikult toimub edasin süntees praimerite seondumissaitide vahel ning selle tulemusel moodustuvadki sama pikkusega DNA- fragmendid. 1. Sekveneeritav DNA denatureeritakse kuumutamisel 92- 95 kraadi juures 30 sekundit 2. Denatureeritud DNA hübridiseeritakse praimeri üleküllusel, 50-60 kraadi juures 30 sekundit, sõltuvalt
Initsiaator-koodonile eelneb ribosoomi sidumispiirkond RBS (ribosomebinding site) ehk Shine- Dalgarno järjestus. BAKTERIAALNE INITSIATSIOON: · IF1 ja IF 3 koos ribosoomi väikese subühikuga ja fMet-tRNAi seondub mRNAle-RBSile, 70S initsiatsioonikompleks saavutatakse kui IF2 vahendatud GTP hüdrolüüsi energia arvelt viiakse kokku väike ja suur alaühik. Shine-Dalgarno järjestus ( Shine-Dalgarno box), on ribosomaalne seondumissait, mis paikneb 6-7 nukleotiidi ülevalpool start koodonist. See on kuue aluseline konsensusjärjestus mis aitab ribosoomi väikesel subühikul õigesti positsioneeruda, kusjuures see toimub üle anti-Shine-Dalgarno järjestuse (CCUCCU) 16S rRNA-l EUKARÜOOTNE INITSIATSIOON toimub mRNA 5' otsa juures: · eIF3 ja eIF6 hoiavad ribosoomi dissotsieerunult. eIF 2, GTP ja Met-tRNA moodustava aktiivse ternaarkompleksi, selle ühinemisel 40S subühikuga
klass 2 (RF3). Esimese klassi vabanemisfaktorid osalevad terminatsioonis ning teise klassi vabanemisfaktor osaleb ribosoomi taaskasutamisel. RF1 tunneb ära UAG koodonit ja RF2 tunneb ära UGA koodonit, mõlemad tunnevad ära UAA koodonit. Vabanemisfaktor liigub A-saiti, kus nende valguline antikoodoni piirkond interakteerub mRNA koodoni piirkonnaga. Vabanemisfaktori õnnestunud seondumisel katalüüsib ta peptiidahela vabanemist ribosoomist. tRNA liikumine ribosoomis: Ribosoomil on mRNA seondumissait ja 3 tRNA seondumissaiti. tRNA seondumissaidid on E ehk väljumissait (exit), P ehk peptidüülsait ja A ehk aminoatsüülsait Ribosoomi mõlemate subühikute seondumine on vajalik tRNA seondumisaitide moodustumiseks 1. A-sait 2. P-sait 3. E-sait - väljub ribosoomist. 31. Mis on polüsoom? Polüsoom on polüribosoom, mis tekib, kui ühe mRNA’ga seondub mitu ribosoomi, mis sünteesivad sama valku. 32. Too näiteid antibiootikumidest, mis blokeerivad ribosoomi tööd
Initsiatsioon: Valgusünteesi initsiatsioonil osalevad lisaks ribosoomidele initsiatsioonifaktorid, initsiaator-tRNA ja GTP. Bakteriaalne initsiatsioon: · ·IF1 ja IF 3 koos ribosoomi väikese subühikuga ja fMet-tRNAi seondub mRNAle-RBSile (Shine-Dalgarno sequence) 70S initsiatsioonikompleks saavutatakse kui IF2 vahendatud GTP hüdrolüüsi energia arvelt viiakse kokku väike ja suur alaühik. Shine-Dalgarno järjestus ( Shine-Dalgarno box), on ribosomaalne seondumissait, mis paikneb 6-7 nukleotiidi ülevalpool start koodonist. See on kuue aluseline konsensusjärjestus mis aitab ribosoomi väikesel subühikul õigesti positsioneeruda, kusjuures se toimub üle anti-Shine- Dalgarno järjestuse (CCUCCU) 16S rRNA-l Eukarüootne initsiatsioon toimub mRNA 5' otsa juures: · eIF3 ja eIF6 hoiavad ribosoomi dissotsieerunult. eIF 2, GTP ja Met-tRNA moodustava aktiivse ternaarkompleksi, selle ühinemisel 40S subühikuga
Regulaatori seondumisala suurem kokkulangevus konsensusjärjestusega esineb geenide puhul, mille avaldumisele on uuritaval regulaatoril tugevam efekt ja siis, kui regulaatorvalk seondub ühte kindlasse saiti promootorala ees. Samas valgud, mis seonduvad paljudesse saitidesse, interakteeruvad tavaliselt ka teiste valkudega. Valkude kooperatiivsel seondumisel DNA-ga ei pruugi uuritava valgu seondumissait olla DNA järjestuse põhjal ennustatav. 2. Reportergeenide kasutamine transkriptsiooni liitjärjestuste konstrueerimiseks. Promootorita reportergeen (näiteks lacZ) inserteeritakse genoomi erinevatesse piirkondadesse, nii et see satub erinevate promootorite kontrolli alla. Edaspidi on võimalik uurida, milliste geenide promootorite kontrolli all muutub reportergeeni ekspressioonitase (tõuseb või langeb) vastusena stressifaktoritele
on konserveerunud sama regulaatori poolt kontrollitavate geenide ees. Regulaatori seondumisala suurem kokkulangevus konsensusjärjestusega esineb geenide puhul, mille avaldumisele on uuritaval regulaatoril tugevam efekt ja siis, kui regulaatorvalk seondub ühte kindlasse saiti promootorala ees. Samas valgud, mis seonduvad paljudesse saitidesse, interakteeruvad tavaliselt ka teiste valkudega. Valkude kooperatiivsel seondumisel DNA-ga ei pruugi uuritava valgu seondumissait olla DNA järjestuse põhjal ennustatav. Suur osa operone on reguleeritavad mitmete erinevate faktorite kooperatiivse seondumise kaudu. Lisaks raskesti ennustatavusele on sellised saidid sageli ka eksperimentaalselt raskesti tõestatavad. 2. Reportergeenide kasutamine transkriptsiooni liitjärjestuste konstrueerimiseks. Promootorita reportergeen (näiteks lacZ) inserteeritakse genoomi erinevatesse piirkondadesse, nii et see satub erinevate promootorite kontrolli alla
Tekib profaag. nt. rekombinaas, mis on lambda integraas, on koht-spetsiifilist integratsiooni läbiviiv ensüüm – türosiin rekombinaas. Koos lisafaktoritega nt. E. coli-l IHF valk (integration host factor) ja cis valk osalevad integreerumises ja on vajalikud lambda faagi integreerumiseks. Integraasil on 2 DNA-ga seondumise piirkonda. Üks on lambda integreerumissait, mis tugevdab integreerumist. Teine on DNA piirkonnaga seondumissait (vajalik, et tööle hakkaks). Mõlema saidi töötamiseks peab DNA kõverduma – võtma sisse kindla kuju. Selle kõverdumise teeb IHF valk. Lambda kasutab seda IHF-i, mis on E. coli-s olemas. Esineb integraas või rekombinaas. Tal on mingis tsentris kindel seriin, kus on protoneeritud hapnik. Reageerib fosfaadiga nii, et DNA aela 5’ fosfaat on kovalentselt rekombinaasiga seotud. Prooton liigub 3’ O külge. 5’ otsa kaudu on DNA-st üks ahel seotud rekombinaasiga. Seriini rekombinaas
annaabi.ee 
