järjeldused vääraks. Genoomi funktsionaalsete elementide ennustamine, kodeerivate geenide ülesleidmine, evolutsioonilise päritolu selgitamine kõiki neid protseduure mõjutab oluliselt koostu kvaliteet. Koostu kvaliteedi probleemi muudab komplekssemaks järjest uuemate sekveneerimistehnoloogiate väljatöötamine. Uued sisendandmed, mis söödetakse programmidele, on teistsuguste iseärasuste ja vigadeprofiiliga kui sekveneerimise teerajajaks osutunud Sangeri meetodi lugemid (read). Seega peavad tarkvarade loojad pidevalt olema arengutega kursis ja kohastuma nii, et loodavad programmid suudaksid andmeid õigesti töödelda. Kuna sisendandmed on kiires muutumises, on keeruliseks osutunud ka seniste koostute kvaliteedi hindamine. Kui genoom saab assembleeritud ehk taas kokkupandud, mille alusel võivad teadlased väita, et tegemist ongi absoluutselt õige koostuga?
defosforüülimist). Siis teostatakse vektori transformeerimine bakterirakku, kus huvipakkuva järjestuse ekspresseeritakse. Seejärel bakteriraku lõhutatakse, jäädes vektori huvipakkuva järjestusega, mille saadakse sekveneerimisele. Iga etapi kontrollitakse elektroforeesi abil, samuti igat puhastamisetappi kontrollitakse mõõdetes kontsentratsiooni. Sekveneerimisel toimub nukleotiidse järjestuse määramine kas Sangeri või Maxam-Gilberti meetodi abil. Kas keemiliste reaktiivide või ensüümide abil. Maxam ja Gilbert: Ühe proovi kohta 5reaktsiooni: G; G+A; T+C; C: A>C - töödeldakse reaktiividega; lõhutatakse juppideks. Saadud DNA fragmendid kantakse geeli peale. (Miinuseks: kui 3 nukleotiidi järjest, halvasti lahutuvad; raske määrata) Sanger: kontrollitakse DNA sünteesi ensüümide abil. Dideoksünukleotiidid (OH asemel H --- seega
funktsiooni.Geeni funktsiooni teadmine on oluline, kuna see sisaldab informatsiooni pärilikkuse kohta. Inimese terve nukleotiidilise järjestuse teadmine annaks võimaluse leida haiguse tekkes osalevaid geene ning õppida paremini tundma haiguste tekkemehhanisme. Hõlbustaks ja täpsustaks haiguste diagnoosimist ning seeläbi tõstaks meditsiini kvaliteeti. Millised olid projekti väljakutsed ning läbimurded ja kuidas on see kujundanud kaasaegse genoomika arengut? 31. Kirjeldage klassikalist Sangeri sekveneerimise protseduuri. 4:11- 13 Ahela terminatsiooni meetod vajab üheahelalist DNAd, DNA praimerit, polümeraasi, vastavaid desoksüribonukleotiidtrifosfaate (dNTP) ja modifitseeritud nukleotiide (didesoksüNTP-d e. ddNTP), millel puuduvad sünteesi jätkamiseks vajalikud 3’-OH rühmad. Kõigepealt liituvad DNA praimerid DNA maatriksmolekuliga täpselt samast kohast, siis seondub sinna DNA polümeraas. Piisava koguse
Bakteri rakkudesse geenide viimisel peame me mRNA alusel tegema DNA. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Rekombinantsed valgud on meile väga praktilised, kuna saame neist toota erinevaid ravimeid nt. insuliini. Kasutatakse veel toidutööstuses ensüümid (piim, juust), keskkonnakaitses (toksiliste jääkide likvideerimine bakterite abil). Kloonitud geenid on kasulikud tegemaks uuritavast geenist kergesti hallatavaid koopiaid ja tootmaks selle põhjal vajaminevat valku. Sangeri sekveneerimise põhimõte. Kasutatakse didesoksüribonukleotiide, mis erinevad desoksüribonukleotiididest selle poolest, et suhkrujäägis ei ole 3’ otsas hüdroksüülrühma, mille tõttu ei saa ahel edasi minna, vaid süntees jääb selle koha peal pidama. Sekveneeritav DNA pannakse reaktsioonianumasse tavaliste desoksüribonukleotiididega ja sünteesitud didesoksüribonukleotiididega. Reaktsioonid viiakse läbi iga lämmastikalust sisaldava
Toimub sildamplifikatsiooni teke, mille tulemusel tekivad identsed DNA klastrid. Peale amplifikatsiooni DNA fragmendid denatureeritaske ja komplementaarsed ahelad pestakse, nii et järgi jäävad vaid ühest otsast kinnitatud DNA üksikahelad. Neile lisatakse sekveneerimispraimerid mis on komplementaarsed DNA otsas olevate oligonukleotiididega. Nüüd on DNA valmis sekveneerimiseks. 18. Mille jaoks kasutatakse järgmise põlvkonna (Sangeri meetod on siin esimene põlvkond) sekveneerimist? Too näide mõnest projektist. Uue põlvkonna sekveneerimistehnoloogiaid on kasutatud erinevates genoomika uurimisvaldkondades, nagu nt kogu genoomi ja transkriptoomi sekveneerimine, transkriptsioonifaktorite seondumissaitide avastamine, mittekodeeriva RNA ekspressiooniprofiili määramine ja suunatud sekveneerimine. Näiteks Human Genome Project (HGP). 19. Uurimaks genotüübi seost haigusega, hinnatakse
5. Tehtud pildist oli arusaadav, et ma ei saanud õige kõrgusega bändi. Nagu selgus, viga oli bakterite kasvamisel ja meil kasvanud bakterite kolooniad polnud tegelikult õiged. Võib olla põhjus selles, et ampitsiliin polnud nii effektiivne ja selektiivne. Need bakterid võiksid sattuda meie tassidele õhust, kuna selles praksiruumis tehakse töid paljude teiste preparaatidega. 63. 64.Sekveneerimise tulemuste analüüs 65. Tavaliselt kontrollitakse saadud plasmiidi kasutades Sangeri meetodit. See meetod põhineb PCR reaktsioonil kuhu on lisaks tavaliste nukleotiidalustele lisatud ka selliseid aluseid, mis om märgitud fluorokroomiga ja mille nukleotiidi ahelasse lülitamise järel DNA pol antud ahela pikendamise lõpetab. Kuna iga terminaalne ddNTP on märgitud erineva fluorokroomiga saab DNA järjestuse teada lahutades saadud reaktsiooni kapillaarelektroforeesil ja lugedes saadud kromatogrammilt flourestsents märgiste järgi meid
polüakrüülamiidelektroforeesil (PAAG). Maxami ja Gilberti meetod seisneb kemikaalidega DNA ahela nukleotiidispetsiifiliste üksikkatkestamiste osalises läbiviimises kindlatüübiliste nukleotiidide juures, DNA 5 ´ otsa radioaktiivses märgistamises ning 3´ otsaliselt eripikkuseliste DNA segmentide parve analüüsis PAAG- elektroforeesil, pärast southern- ülekannet fragmnetide visualiseerimises membraanfiltrite autoradiograafial. DNA ahel katkestatase keemiliste ainetega. Sangeri meetod põhineb in vitro DNA sünteesil radioaktiivselt märgistatud nukleotiidide ja spetsiifiliste DNA ahela terminaatornukleotiidide juuresolekul. Ka siin on erinevaid reaktsioonisegusid 4, kus lisaks radioaktiivselt märgistatud nukleotiididele on ka üks terminaatornukleotiid, mis lõpetab DNA sünteesi kas A, G, C või T-terminaatoriga, enamasti kasutatakse ddTNP-sid. Tänapäeval kasutatakse fluorestsentmärgitusi, fragmendid jaotatakse PAAG- elektroforeesil erinevates
lookustes. Tulemuseks oli populatsioonigeneetika sünd 20.sajandi alguses. 2. Alates 1960-st edasi – tekkised andmed varieeruvusest molekulaarsel tasemel. Valkude elektroforees. Tulemused: selgus, et varieeruvust on palju rohkem kui seni arvati. Selle seletamiseks loodi neutraalne moekulaarse evoutsiooni teooria. 3. 1980-st edasi – andmete kogumine: PCR, DNA sekveneerimine Sangeri meetodil, restriktsiooniensüümide kasutamine DNA järjestuserinevuste kontrollil ja mikrosatelliitide korduste arvu määramine. Tulemuseks koalesentsiteooria sünd ja areng ning paljude liikide demograafilise ajaloo kirjeldamine. 4. Tänapäev – andmete kogumisel kasutatakse genotüpiseerimiskiipe ja uue põlvkonna sekveneerimist. Tulemuseks on kvalitatiivselt uut tüüpi
ja biomeetrikute saadud pidevad andmed looduslike populatsioonide kohta. Kadus vastuolu kahe koolkonna vahel. 2) 1960-1980: Molekulaarsete andmete kogumise andmed, nt valkude elektroforeesilt. Avastati, et mutatsioone on rohkem, kui arvati, ja tekkis Neutraalne molekulaarse evolutsiooni teooria (NMET) ja Peaaegu neutraalne molekulaarse evolutsiooni teooria (PNMET). Samuti molekulaarse kella teooria. 3) Alates 1980: Andmed DNA-s leiduvate mutatsioonide kohta (PCR, Sangeri sekveneerimine, restriktsioonanalüüs, mikrosatelliitide analüüs). Kasutati palju mtDNA ja Y kromosoomi andmeid. Tulemusena sündis koalestsentsiteooria ja kirjeldati suhteliselt täpselt paljude looduslike populatsioonide demograafiline ajalugu, sh inimese puhul. (Meetoditena feneetika: erinevuste uurimine, fülogeneetika: erinevuste tekkimise uurimine.) 4) Alates 2000: Uued sekveneerimistehnikad on võimaldanud saada rohkem genoomseid andmeid, ka
Genoomide sekveneerimine Inimese genoomi sekveneerimiseks käivitati teadusprojekt, kuhu kaasati laborid erinevatest riikidest. Töö koordineerimiseks loodi rahvusvaheline Inimese Genoomi Organisatsioon HUGO (Human Genome Organization). Esimeseks projekti juhiks oli James Watson, kes koos Francis Crick'iga oli kirjeldanud DNA kaksikhelikaalse struktuuri. 1993-ndast aastast juhib projekti Francis Collins. Töö jaotati erinevate teaduslaborite vahel (põhilised tegijad 8 laborit USA-st ja Sangeri Keskus Inglismaalt). 1998. aastal moodustas J. Craig Venter (juhtis enne seda Rockvilli Genoomiuuringute Instituuti Marylandis ja oli seni sekveneerinud mitmete bakterite genoome) firma Celera Inc. Projekti finantseeris Perkin-Elmer korporatsioon. Venter lubas sekveneerida inimese genoomi täielikult kolme aasta jooksul. Võrreldes HGP projektiga olid Venteril kasutada uut tüüpi, võimsamad automaatsekvenaatorid. Konkurents inimese genoomi sekveneerimisel kiirendas ka HGP tegevust
Genoomide sekveneerimine Inimese genoomi sekveneerimiseks käivitati teadusprojekt, kuhu kaasati laborid erinevatest riikidest. Töö koordineerimiseks loodi rahvusvaheline Inimese Genoomi Organisatsioon HUGO (Human Genome Organization). Esimeseks projekti juhiks oli James Watson, kes koos Francis Crick'iga oli kirjeldanud DNA kaksikhelikaalse struktuuri. 1993-ndast aastast juhib projekti Francis Collins. Töö jaotati erinevate teaduslaborite vahel (põhilised tegijad 8 laborit USA-st ja Sangeri Keskus Inglismaalt). 1998. aastal moodustas J. Craig Venter (juhtis enne seda Rockvilli Genoomiuuringute Instituuti Marylandis ja oli seni sekveneerinud mitmete bakterite genoome) firma Celera Inc. Projekti finantseeris Perkin-Elmer korporatsioon. Venter lubas sekveneerida inimese genoomi täielikult kolme aasta jooksul. Võrreldes HGP projektiga olid Venteril kasutada uut tüüpi, võimsamad automaatsekvenaatorid. Konkurents inimese genoomi sekveneerimisel kiirendas ka HGP tegevust
annaabi.ee 
