Ometi võib kloonimisest ka kasu olla. Näiteks arvavad teadlased, et kloonimise teel võiks paljundada hävimisohtu sattunud loomaliike. DNA kloonimise etapid: Tavalises kloonimise katses koosneb iga DNA fragmendi kloonimine seitsmest etapist 1. Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik 2. Vektor-DNA ettevalmistamine 3. Kloonitava DNA ettevalmistamine 4. Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil 5. Rekombinantse DNA sisestamine peremeesorganismi 6. Rekombinantide selekteerimine 7. Rekombinantide analüüsimine (screening) Tõhus loomade kloneerimise tehnoloogia võimaldab uusi võimalusi loomakasvatuses, inimmeditsiinis ning samuti loomade säilitamisel ja kaitsmisel. Tuuma kloonimine hõlmab loomade tootmist, kes on geneetiliselt identsed doonorrakkudele- seda tehnoloogiat tuntakse ka kui tuuma ülekande tehnoloogia (NT- nuclear transfer). Hetkel on see aga mitte nii efektiivne protsess: veiste puhul ainult umbes 6% embrüotest on reproduktiivsed
nakatati tüve K12 Tüves K12 paljunesid ainult rekombinandid, kus oli taastunud algne fenotüüp Tüve K-12 nakatamisel saadud faagilaigud loendati ja arvutati rekombinatsioonisagedus: Rekombinatsioonisageduse arvutamine Rekombinatsioonisagedus: 2 x metsiktüüpi rekombinantide arv Faagide üldarv Metsiktüüpi rekombinantide arv on vaja 2-ga korrutada, kuna lisaks neile tekib sama palju ka topeltmutante Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks määratakse faagi tiiter – baktereid nakatavate
ristsiirdel nad samasse kromatiidi üksusesse jäävad. Kui on üle 50% rekombinante, siis järelikult on geenid lausa erinevates kromosoomides. 32. Millest on tingitud erinevused kromosoomide geneetilisel ja füüsilisel kaardil? Geneetiline kaart näitab küll järjekorda kaardil, kuid füüsilist distantsi mitte alati, sest kromosoomis ühed alad on rohkem kokkusurutud ja teised välja venitatud, rekombinantide analüüs aga seda arvesse ei võta. Ristsiire ei toimu ka igas piirkonnas sama suure tõenäsusega. Kromosoomis geenid saavad asuda kaugemal kui 50cM, kuid rekombinantide sagedus teoreetiiselt ei saa olla üle 50%. Kaugus hinnatuna rekombinantide esinemissageduse alusel on täpne kuni 25cM kaugusel asuvate geenide puhul. Kaugemal on tõenäoline, et ristsiire võis toimuda kahel korral, seega tekiks rekombinant, vaatamata ristsiirdele. 33
Füüsiline lookuste vahetus kromosoomi otstes peaks toimuma 50% sagedusega, ühes tasapinnas jäävad vanemkromatiidid, teises tasapinnas rekombinantsed. Geneetiline kromosoomide kaart: Geneetiliste rekombinatsioonid sagedus (%) näitab aheldatuse ulatust. Geneetilised kaardid koostatakse lähtuvalt rekombineerumise eksperimentidest. Ristsiire toimb seda sagedamini, mida kaugemal lookused üksteisest paiknevad. Oodatav rekombinantsete ja vanemgenotüüpide suhe kui aheldatus puudub on 1:1. Rekombinantide sagedus (%) määrab vahetult geneetilise kauguse (mu). Kaugus on seda täpsem, mida lähemal lookused üksteisele asuvad. Mida rohkem järglaskonda (arvukus) seda täpsem tulemus. Otsene vastavus geenide lineaarse paigutusega kromosoomis. Erinevalt aheldunud lookuste kaardistamine testristamistega: 3-lookuse suhtes (Aa/Bb/Cc x aa/bb/cc) võimaldab vaadelda mitut tunnust üheaegselt. Rekombinantide sagedust (nn. Aheldatuse vahekord) kasutatakse järglaste fenotüüpide
komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita, tekib rekombinantne DNA. Restriktaasid on ensüümid, mis katkestavad hüdrolüüsi fosfordiester sidemel, tunnevad ära 6 järjestust iga restriktaas tunneb erineva. DNA kloneerimise etapid. Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik Vektor-DNA ettevalmistamine Kloonitava DNA ettevalmistamine Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil Rekombinantse DNA sisendamine peremeesorganismi Rekombinantide selekteerimine Rekombinantide analüüsimine Etapp 1. Valitud DNA tükk lõigatakse päritoluorganismist restriktsiooniensüümide abil. Etapp 2. DNA tükk „kleebitakse“ vektorisse ja DNA otsad liidetakse vektori DNA-ga ligeerimise teel. Etapp 3. Vektor sisestatakse peremeesrakku, sageli bakterisse või pärmi. Peremeesrakud kopeerivad vektori DNA koos oma DNA-ga, luues sisestatud DNA-st mitu eksemplari/koopiat. Etapp 4
selle kaotsiminekut või lisandumist. 29. Mis on geenide aheldatus? Tooge näide. Geenide aheldatus geenid paiknevad krom-s lineaarselt ja samas kromosoomis olevad geenid päranduvad koos. Teatud juhtudel ei jää geenid aheldatuks: meioosis võib toimuda homoloogiliste kromosoomide kromatiidiosade vahetus e ristsiire. See põhjustab kõrvalekaldeid Mendeli sõltumatu lahknemise seadusest. Geenide aheldumisele viitab rekombinantide (vanemtüübist erineva fenotüübiga järglaste) madal sagedus F2 põlvkonnas. Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks jagatakse rekombinantide arv kogu järglaskonna arvuga. Kui see ületab väärtuse 0,5 (50%), pole geenid aheldunud, vaid paiknevad erinevates kromosoomides. Heterosügootide eristamiseks nende dominantsete alleelide aheldatuse suhtes kasutatakse kindlat kirjaviisi: 1) coupling heterozygote (R&L, r&l) dominantsed alleelid on tõmbefaasis
40. Restriktaasid Ehk restriktsoonilised ensüümid. Bakteriaalsed kaitsesüsteemid kaitsmaks baktereid võõraste DNAde eest. 41. DNA kloneerimise etapid 1. Peremeesorganismi ja kloonimisvektori valik. 2. Vektor DNA ettevalmistamine. 3. Kloonitava DNA ettevalmistamine. 4. Rekombinantse DNA sünteesimine ligatsiooni abil. 5. Rekombinantse DNA sisestamine peremeesorganismi → hakkab seal paljunema. 6. Rekombinantide selekteerimine (need, mille rakud on vastu võtnud + paljundanud) 7. Rekombinantide analüüsimine Rekombinantne DNA – DNA molekul, mis on kunstlikult kokku pandud mitest erinevast DNA fragmendist, mis pärinevad sageli erinevatest organismides. Selle DNA tegemise eesmärgiks luua DNA molekul, mida vabas looduses ei leidu ja millel on mingid uued omadused. Selle kombineerumine on võimalik, kuna kõikidel organismidel on DNA keemiline
Geenid, mis paiknevad üksteise suhtes lähestikku, on tugevamalt aheldunud ning rekombineeruvad harvemini. Seega võimaldab geenidevahelise rekombinatsiooni sagedus hinnata nendevahelist aheldatust. Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks ristatakse uuritavate tunnuste suhtes aheldunud geenidega isendeid, näiteks eelpoolkirjeldatud heterosügootseid F1 põlvkonna suhkruherneid mõlema retsessiivse alleeli suhtes homosügootsete suhkruhernestega ja jagatakse rekombinantide arv kogu järglaskonna arvuga. Kui rekombinatsiooni pole toimunud, peaksid 50% järglastest olema fenotüübilt sarnased ühele vanemale ja 50% teisele vanemale. Oletame, et 1000-st järglasest 450 sarnanesid fenotüübilt heterosügootsele F1 põlvkonnast vanemale (punaseõielised, pikkade tolmuteradega) ja 470 homosügootsele retsessiivsele vanemale (valgete õitega, ümarate tolmuteradega). Oli ka rekombinante: 42 punaste õitega ja ümarate
Geenid, mis paiknevad üksteise suhtes lähestikku, on tugevamalt aheldunud ning rekombineeruvad harvemini. Seega võimaldab geenidevahelise rekombinatsiooni sagedus hinnata nendevahelist aheldatust. Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks ristatakse uuritavate tunnuste suhtes aheldunud geenidega isendeid, näiteks eelpoolkirjeldatud heterosügootseid F1 põlvkonna suhkruherneid mõlema retsessiivse alleeli suhtes homosügootsete suhkruhernestega ja jagatakse rekombinantide arv kogu järglaskonna arvuga. Kui rekombinatsiooni pole toimunud, peaksid 50% järglastest olema fenotüübilt sarnased ühele vanemale ja 50% teisele vanemale. Oletame, et 1000-st järglasest 450 sarnanesid fenotüübilt heterosügootsele F1 põlvkonnast vanemale (punaseõielised, pikkade tolmuteradega) ja 470 homosügootsele retsessiivsele vanemale (valgete õitega, ümarate tolmuteradega). Oli ka rekombinante: 42 punaste õitega ja ümarate
valgeõieliste ümarate tolmuteradega järglaste vajel 3:1 - nagu monohübriidsel ristamisel. Siit saab järeldada, et vaadeldavad geenid kanduvad enamasti koos sest nad on aheldunud ja rekombinantsed järglased peavad moodustama geenide ristsiirde tulemusel. F1 põlvkonna gameetide moodustumisel toimus meioosis ristsiire, mille tulemusena tekkisid rekombinatsed kromosoomid, kus alleelid homoloogilistes kromosoomides olid vahetunud. Geenide aheldumisele viitab rekombinantide (vanemtüübist erineva fenotüübiga järglaste) madal sagedus F2 põlvkonnas Kui geenid asuvad samas kromosoomis, siis päranduvad nad koos samasse gameeti. 30. Geneetilise materjali rekombineerumine ristsiirde teel. Teatud juhtudel ei jää geenid aheldatuks: meioosis võib toimuda homoloogiliste kromosoomide kromatiidiosade vahetus e. ristsiire (crossing over). Ristriirde protsessis osaleb homoloogilistest kromosoomidest 1 tütarkromatiid. 20
ruumiliselt eraldatud, edasi lükatud. Võib-olla annab see rohkem aega rekombinatsioonide tekkeks. Võiks öelda, et suguline protsess on toimunud ilma nähtava sugulise paljunemiseta. Sellisel juhul on ilma viljakehade moodustamiseta kasvava seene hüüfil justkui klonaalselt tekkivad koniidid rekombinantsed venitatud ja varjatud meioosi tõttu. Paraku ei allu rekombinatsioonide lahknemine antud juhul populatsioonigeneetika seadustele (rekombinantsete koniidide ebavõrdne arvukus? rekombinantide ebavõrdne lahknemine?). Veelgi huvitavam on see, et mitootiline geenivahetus võib toimuda ka klonaalselt paljunevas pärmirakus. Sugulise paljunemiseta diploidsed pärmid on heterosügootsed (!). Mitootilised rekombinatsioonid tekivad klonaalselt paljunevas pärmi Candida albicans rakus kahe haploidse genoomi komponentide vahel (Fincham et al., 1979). Sellel liigil haploidiseerumist ei toimu (meioosi teine jagunemine puudub). Küll aga
Geenid, mis paiknevad üksteise suhtes lähestikku, on tugevamalt aheldunud ning rekombineeruvad harvemini. Seega võimaldab geenidevahelise rekombinatsiooni sagedus hinnata nendevahelist aheldatust. Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks ristatakse uuritavate tunnuste suhtes aheldunud geenidega isendeid, näiteks eelpoolkirjeldatud heterosügootseid F1 põlvkonna suhkruherneid mõlema retsessiivse alleeli suhtes homosügootsete suhkruhernestega ja jagatakse rekombinantide arv kogu järglaskonna arvuga. Kui rekombinatsiooni pole toimunud, peaksid 50% järglastest olema fenotüübilt sarnased ühele vanemale ja 50% teisele vanemale. Oletame, et 1000-st järglasest 450 sarnanesid fenotüübilt heterosügootsele F 1 põlvkonnast vanemale (punaseõielised, pikkade tolmuteradega) ja 470 homosügootsele retsessiivsele vanemale (valgete õitega, ümarate tolmuteradega). Oli ka rekombinante: 42 punaste õitega ja ümarate
Geenid, mis paiknevad üksteise suhtes lähestikku, on tugevamalt aheldunud ning rekombineeruvad harvemini. Seega võimaldab geenidevahelise rekombinatsiooni sagedus hinnata nendevahelist aheldatust. Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks ristatakse uuritavate tunnuste suhtes aheldunud geenidega isendeid, näiteks eelpoolkirjeldatud heterosügootseid F1 põlvkonna suhkruherneid mõlema retsessiivse alleeli suhtes homosügootsete suhkruhernestega ja jagatakse rekombinantide arv kogu järglaskonna arvuga. Kui rekombinatsiooni pole toimunud, peaksid 50% järglastest olema fenotüübilt sarnased ühele vanemale ja 50% teisele vanemale. Oletame, et 1000-st järglasest 450 sarnanesid fenotüübilt heterosügootsele F 1 põlvkonnast vanemale (punaseõielised, pikkade tolmuteradega) ja 470 homosügootsele retsessiivsele vanemale (valgete õitega, ümarate tolmuteradega). Oli ka rekombinante: 42 punaste õitega ja ümarate
Mõnede regioonide vahel ümberkombineerumine sagedam kui teistel kaugused geneetilisel kaardil ei vasta täpselt kaugustele füüsilisel. Ümberkombineerumine väiksema TN kromosoomi otste lähedal & tsentromeeri piirkonnas. Need piirkonnad geneetilisel kaardil kokku surutud, ülejäänud regioonid (ristsiirete TN kõrgem) välja venitatud. Nii geneetilised kui füüsilised kromosoomikaardid kolineaarsed ehk konkreetsed geenid mõlemal kaardil samas järjekorras rekombinantide analüüs määrab geenide järjekorda kromosoomis, kuid mitte nendevahelisi füüsilisi kaugusi. 33. Pagaripärmi Saccharomyces cerevisiae elutsükkel. Kasutamine ristsiirde uurimisel. 1-rakuline haploidne organism paljuneb tavaliselt mitteseksuaalsel teel pungudes. Sugulisel paljunemisel liituvad 2 haploidset erineva ristumistüübiga rakku a & diploidne rakk tekib 4 haploidset rakku, askospoori, jäävad kokku kotikesse e askusesse. Askospooridest haploidsed pärmirakud
Toimub meioosi profaasis, pachynema staadiums. Rekombineerumise tagajärjel tekivad uued alleelide kombinatsioonid. Võimalus suurendada geneetilist varieeruvust. Näiteks 1 liik paljuneb suguliselt, teine paljuneb mittesuguliselt. Mittesugulisel paljunemise puhul puudub võimalus kasulike mutatsioonide rekombineerumiseks ja edasiseks kooselevimiseks populatsioonis. 36. Geenide kaardistamine Neurospora crassa askuste analüüsil. Leides rekombinantide tekkesageduse ning keskmise ristsiirete arvu uuritavate geenide suhtes, saab määrata ka 3 ja enama geeni vahelise geneetilise distantsi, et koostada selle põhjal geneetiline kaart. Erinevalt pärmist on Neurospora askospooride kott piklik ja väga kitsas, nii et spooride reastumine askuses kajastab seda, kuidas reastusid kromatiidid meioosis. Meioosi käigus rakud ei pooldu, tuumad jäävad kõrvuti ning
avaldumise kohaselt. Peale grupi numbri tähistatakse tsentromeeri asukoht ning mutantsete geenide nimetusi, nende vahemaad morganiidides ühest kromosoomi lopust, mida vaadeldakse null punktina. 70. Geenide geneetiline ja füüsiline kaugus. Hiid- e. polüteensed kromosoomid. Enamasti toimub pikemate kromosoomide vahel rohkem ristsiirdeid kui lühemate vahel. Seega ei vasta kaugused geneetilisel kaardil täpselt kaugustele kromosoomi füüsilisel kaardil. Rekombinantide analüüs võimaldab määrata geenide järjekorda kromosoomis, kuid mitte füüsilisi kaugusi. Piirkonnad, millel tõenäosus, et seal toimuvad ristsiirded, on suurem, on välja venitatud ja need, kus see tõenäosus on väiksem, on kokku surutud. Hiid- e. polüteensed kromosoomid - paljuniidilised kromosoomid, mille tütarkromatiidid ei eraldu ja mis võivad koosneda paljudest paralleelselt kulgevatest kromosoomi replikatsiooniproduktidest.
annaabi.ee 
