Geenid võivad liikude rõngaskromosoomist plasmiididesse ja sealt tagasi. Mittevajalikud plasmiidid lagundatakse vastavate ensüümide poolt. Eeltuumse raku sisemuses puuduvad membraanidest koosnevad rakustruktuurid ja nendega ümbritsetud organellid (tsütoplasmavõrgustik, Golgi kompleks, kloroplast, mitokondrid, tsentrosoom, tsütoskelett). Bakterid koosnevad kapslist, sisaldisest, tsütoplasmast, tuumapiirkonnast, ribosoomidest (toimub valgusüntees, mõõtmetelt väiksemad), plasmiidist, karvakestest, viburitest, rakumembraanist, rakukestast ja limakapslist. Ainete kandumine raku ühest osast teise toimub valdavalt difusiooni teel. Gaasivakuoolid on valgulise membraaniga põiekesed, mis esinevad mõnede bakterite tsütoplasmas (aitavad vees elavatel organismil pinnale tõusta või laskuda). Bakterid paljunevad pooldumise teel (eelneb raku kasvamine ja varuainete süntees) ning suhteliselt kiiresti
teistest organismist Konjugatsioon Plasmiidi või kromosomaalse fragmendi ülekanne doonorrakust retsipientrakku läbi otsese sideme Gram-negatiivsel doonorrakul on fertiilsusplasmiid e. F-plasmiid, mis võimaldab sünteesida konjugatsiooni e. Sekspili Retsipient on samasse liiki või perekonda kuuluv rakk, millel puudub F- plasmiid Doonor kannab F-plasmiidi üle retsipiendile läbi pili Konjugatsioonil osa kromosoomist ja osa F-plasmiidist kantakse üle retsipiendile Transformatsioon Organismi geneetiline muutumine võõr-DNA rakku sisenemise tagajärjel. Nt. Lüüsunud raku kromosoomi fragmendid võetakse retsipientraku poolt vastu, kus see siis liidetakse viimase geneetilisse materjali Doonor – ja retsipientrakud ei pea olema seotud Annab hea võimaluse DNAga manipuleerimiseks ja valkude ekspressiooniks Transduktsioon Bakteriodaagide vahendusel geneetilise informatsiooni kandumine ühelt
Ungari, Gruusia, Rumeenia, Türgi, Bulgaaria, Küpros, Kreeka, Serbia-Montenegro, Horvaatia, Sloveenia, Malta, Itaalia, Austria, Sveits, Hispaania, Portugal, Prantsusmaa, Saksamaa.6 5 http://www.eko.org.ee/gmo/index.php 6 http://www.gmo-free-regions.org/ 8 GMO'de tootmine GMO'de saamiseks lõikab restriktaas (,,ensüümkäärid") DNA-d spetsiifilistest kohtadest, plasmiidist (rõngakujuline kaheahelaline DNA molekul) eraldatakse mittevajalikud geenid ja DNA ligaas (ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad) ühendab fragmendid. Doonororganismist eraldub uus geen, mis viiakse Agrobacterium tumefaciens'i. Uus plasmiid siseneb taime rakkudesse lehe lõikepinnal ja neid lehe lõike töödeldakse Agrobacterium'i (Gram-negatiivsesse perekonda kuuluv bakter, mis kasutab horisontaalset geenisiiret kasvajate põhjustamiseks taimedel) rakkude lahuses
Agrobacteriumi abil (loeng 7) Biolistika - Mehhaaniline meetod Nö. Geeni püss ja kullast kuulid Kulla osakesed kaetakse DNAga ja tulistatakse taime kudedesse DNA satuvad raku sisse ja 12 tunniga siseneb DNA tuuma ja integreerub taime genoomi. Kuld kogutakse vakuoolidesse ja saadetakse taimest välja Agrobacteriumi abil - Bakter · Taime patogeen · Põhjustab kasvajalaadset kasvu taimedel · Sisaldab plasmiidi (tumor-inducing plasmid) · Võimeline integreerima osa Ti plasmiidist (Transfer-DNA) taime genoomi · Ti plasmiidi saab modifitseerida, et DNA vektorit sinna panna. (loeng 7) Putukaresistentsed taimed - Toksiin: Bt-valk, mis on eraldatud Bacillus thuringiensis bakterist Tapab: 7 Liblikalised (lepidoptera) (liblikad, ööliblikad) Kahetiivalised (diptera) (kärbsed, sääsed) Mardikalised (coleoptera) (mardikad) Põllumajanduslik tähtsus: varreleedik, maisi juure uss ja puuvilla kuprauss Toksiini toime:
tuntud võimendusprotsessidena, tekitatakse signaal ensüümidega, mis on seotud tuvastusantikehade külge kindlates kogustes, et võimaldada täpne kvantitatiivne määramine. Kasutatakse haiguste diagnostikas, oli esimene laialdasem HIV tuvastusmeetod, rotaviirus väljaheidetes, malaaria. Toiduallergeenide tuvastamine toidutööstuses. Saab tuvastada kiirelt ka teatud narkootikume. 64. Mis on fagemiidid ja milleks neid kasutatakse? Kloonimisvektor, mis sisaldab nii faagi kromosoomist kui ka plasmiidist pärit komponente. Kasutatakse antikeha-raamatukogu faagikuva meetodis. 65. Mis on faagikuva? Varaseim ja enim kasutatud meetod antikehade selekteerimiseks raamatukogudest, kus antikeha fragmendid kuvatakse filamentse bakteriofaagi pinnal pinnavalgu p3 koostises. Võeti kasutusele 90ndatel. 66. Mis on terapeutilised antikehad ja kuidas neid jaotatakse? Detailsed kirjeldused. Terapeutilised antikehad on immunoglobuliinid või nende fragmendid, mida kasutatakse haiguste raviks. Mono- ja
mõju alla vms. plasmiidides sisalduvad geenid enamasti kodeerivadki looduses just taolisi valke, mis on vajalikud ebasoodsates keskkonnatingimustes toime tulla. Geenitehnoloogias on plasmiidid olulised, sest esiteks on nad suhteliselt väiksed DNA molekulid, seega on nendega katseklaasi manipulatsioone lihtsam teha. Teiseks on plasmiidset DNA'd rakus palju ja lihtne bakteritega paljundada. Seega teeme ühest plasmiidist bakterite abil baktereis palju identseid koopiaid kloone. Kui meil on suured DNA molekulid tuhandete geenidega, milledest paljudel teame nukleotiidset järjestust js sellest aminohappelist järjestust valgus, kuid see ei ütle midagi, mida see 3
Kõrge LF tase hävitab leukotsüüdid ja bakter pääseb organismi. EF tõstab cAMP taset. Koos EF on peremees nakkusele tundlikum cAMP taseme tõus suurendab vedeliku akumulatsiooni rakkudesse. Teine plasmiidis kodeeritud valk PA (protective antigen) laseb toksilised valgud rakkudesse. PA moodustab multimeerse rõnga mis inserteerub peremehe rakumembraani. PA üksikuna pole toksiline ning inaktiveertuna pole ka toksilised valgud enam ohtlikud. Kapsli teke sõltub pXO2 plasmiidist. Kapsli teke on infektsioonis väga oluline, kuna muudab patogeeni fagotsütoosi suhtes resistentseks. 19. Muhkkatk ja plasmiidid 20. Transponeeruvad elemendid IS elemendid- 1-2 kb, kodeeritakse vaid transpositsiooniks vajalikke valke. Otstes pöördkordus järjestused (IR- inverted repeats- 16...40 bp). Genoomis on IS otste juures otsekordusjärjestused DR- directed repeats Transposoonid (Tn) on IS elementidest suuremad ning kodeerivad lisaks transpositsiooniga
õigesti ja katte saadud plasmiidne DNA sisaldab õige järjestusi ja saadud plasmiidi täpsemaks analüüsimiseks on vaja see sekvineerima. 1) Sekveneerimise tulemuste analüüs Mina valisin analüüsimiseks sekvents nr 13 L-Desmo_t7_e02 (tõenäoliset saadud minu plasmiidist, kuna märgistasin oma pridukti L tähega). Kopeerisin sekvensi Chromast Blasti ja võrreldades Word failis oleva järjestusega, sain teada, eti minu insert kleepus vektoriga kokku valepidi, ehk mul tegu on reverse complementiga. Selleks, et leida
Mõnedel plasmiididel on geenid, mis tagavad plasmiidi stabiilse püsimise bakterirakus, näiteks toksiini-antitoksiini süsteemi kodeerivad geenid. Kuigi plasmiidid pole bakterite populatsiooni kasvuks ja bakteritele elutähtsateks funktsioonideks vajalikud, siis teatud juhtudel, näiteks ebasoodsate keskkonnatingimuste korral, võib plasmiidi olemasolu oluliselt soodustada bakteriraku ellujäämist. Soodsates keskkonnatingimustes võib bakterirakk plasmiidist vabaneda, ilma et sellele järgneks peremeesraku jaoks eluohtlikke tagajärgi. Plasmiidid kanduvad ühest bakterirakust teise peremeesraku pooldumise ajal ja horisontaalselt, peamiselt konjugatsiooni teel. Plasmiidide olemasolu on rakkudele kasulik: paljud plasmiidide omadused aitavad rakul kindlates tingimustes ellu jääda. Need tunnused jagatakse nelja peamisse rühma: 1. resistentsus kannavad resistentsust raskmetallide, antibiootikumide suhtes; 2
Insenerigeneetikas nim plasmiide vektoriteks. 6. DNA kloonimise põhietapid isepaljunevas süsteemis. 1. plasmiid isoleeritakse bakterirakust (E. coli) 2. plasmiidi lõigatakse kindla restriktaasiga 3. sama restriktaasiga lõigatakse huvipakkuv DNA lôik kromosoomist välja 4. isoleeritud DNA lõik "istutatakse" plasmiidi 5. plasmiid viiakse bakterirakku, bakter kasvab ja plasmiid paljuneb 6. paljundatud geen isoleeritakse plasmiidist. 7. Milleks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on PCRi põhietapid? Kasutatakse uuritava DNA lõigu paljundamiseks in vitro.Geenide polümorfismi detekteerimine. Vajatakse: * kaks praimerit – peavad olema komplementaarsed uuritava DNA ahelate otstega * maatriks * termostabiilset Taq polümeraasi * vabu nukleotiide * puhvrit. Põhietapid: 1. DNA denaturatsioon üheahelaliseks (95 kraadi)
rhizogenes´i suur rõngasplasmiid, mis põhjustab taimedel kalluskasvajate (haiguste) induktsiooni ning mis on tähtsaks vektoriks geenide ülekandel (eriti kahekojalistesse) taimedesse. Plasmiidse DNA Agrobacterium’i vahendatud ülekanne vigastatud taime. Ti-plasmiidi kandev Agrobacterium meelitatakse atsetosüringooni abil (toodetakse vigastatud taime poolt) vigastuskohta. Endonukleaasi toimel lõigatakse Ti-plasmiidist välja üksikahelaline T-DNA, seotakse kaitsvate valkudega ja transporditakse taimerakku konjugatsioonisarnasel meetodil. T-DNA siseneb taimeraku tuuma, kus ta integreerub taime kromosoomse DNA-ga. 9. Transgeensete loomade saamisviisid A. Rekombinantse DNA mikrosüstimine pronukleuse lähedusse. B. Somaatiliste rakkude reprogrammeeritud tuumade transplantatsioon tuumata munarakku. C
transposoonid. Kannavad geene, mis flankeeruvad IS elementide mõlemas otsas (antibiootikumi resistentsus). IS elemendid varustavad transposaasiga ja ITR äratundmise signaali. Mittekomposiitsed kannavad samuti geene, aga ei termineeri IS elemendiga. Lõpevad sarnaste kordusjärjestustega. Transponeerumine on sarnane IS elementidele; kohapeal toimub duplikatsioon. Kointegreerumine transposooni üleminekul ühest genoomi osast (plasmiidist kromosoomi) intereerub see duplikatsiooniga mõlemas. Võib siis olla replikeeruv (duplikatsioon) või mitte (kaob originaalsaidist). Sama tüüpi mutatsioonid mis IS korral. Ristsiire esineb kui doonor DNA koos tarnsposoniga sulandub retsipiendi DNAga. 3. Bakterifaagid mutaatorjärjestus (Mu): Infitseerimisel Mu integreerub mittereplikeeruval transponeerumisel ja replitseerub koos E. coli paljunemisega. Lüütilises tsüklis jääb Mu E
- boosting – immuunvastuse tugevnemine (mutatsioonide sündmus) T-DNA eriline somaatiline rekombinatsioon, taime ja temaga koos oleva mikroobi vahel. Taim kasvab seal, kus ei peaks (nt pole substraati); mükoriisa puhul seened aitavad (taim seenelt vett ja mineraalaineid, seen taimelt orgaanilisi aineid). Nt Agrobacterium – koloniseerib taime juuri. Saadab oma DNA taimerakku, kus DNA hakkab taime instrueerima uute ühendite sünteesiks, mida tavaliselt taim ei tee. Bakteri annab osa plasmiidist, mis läheb peremeesraku tuuma, siseneb tema kromosoom ja hakkab seal paljunema. Vasakpoole järjestus jääb bakteri plasmiidi, parempoolne kordusjärjestus läheb taimeraku tuuma. Taim hakkab tootma nopaliin ja oktapiin (ained, mis on bakterile söögiks). Ti-plasmiid sisaldab teisigi geene: osa DNA ülekandeks, osa juurdekasvu, osa võrsekasvu indutseerimiseks. Ti – epikromosomaalne geneetiline element. Oluline transgeensete taimede tegemiseks. Kui bakteri DNA siseneb, siis toimub
annaabi.ee 
