fragmentideks. Viivisahela sünteesimine DNA praimaas sünteesib DNA järjestuse pealt lühikese RNA praimeri DNA polümeraas jätkab DNA sünteesi - moodustub Okazaki fragment eesolev RNA praimer asendatakse DNA-ga Okazaki fragmentide katkekohad liidetakse DNA ligaasi abil Okazaki fragmentide sünteesiks on vajalik ensüüm- DNA praimaas, mis sünteesib nn. praimeri - lühikese RNA oligonukleotiidi. Praimaasi töö tulemusena moodustub DNA-RNA hübriidahel, kus uuesti sünteesitud RNA aluspaarid on seotud DNA aluspaaridega vesiniksideme kaudu. Praimaas jätab vaba 3’-OH otsa- see on edasiseks sünteesiks vajalik. DNA replikatsiooni protsess Replikatsioon saab alguse replikatsiooni alguspunktist. Helikaas harutab lahti kaheahelalise DNA. Praimaas sünteesib RNA oligonukleotiidi. DNA polümeraas sünteesib uue DNA ahela. Ligaas seob DNA fragmendid kokku
tehnoloogia? a) DNA polümeraasi 3'-5' eksonukleaassel aktiivsusel b) DNA polümeraasi 5'-3' eksonukleaassel aktiivsusel c) DNA polümeraasi termostabiilsusel 3. Milliseid mehhanisme kasutatakse rakus geeniekspressiooni inhibeerimisel antisense DNA oligonukleotiididega? a) Moodustuva antisense oligonukleotiid/mRNA kompleksi katkilõikamine restriktsioonilise endonukleaasiga b) Translatsiooni blokeerimine oligonukleotiidi poolt c) DNA oligonukleotiid/mRNA kompleksi degradatsioon Dicer ensüümi poolt d) RNaasH vahendatud mRNA degradatsioon oligonukleotiid/mRNA dupleksist 4. Milline järgnevatest nukleiinhappe ahelate dupleksitest on hübridisatsioonil kõige stabiilsem? a) DNA:RNA b) DNA:DNA c) RNA:RNA 5. Mis on ribosüüm? a) Spetsiifilise sihtmärkjärjestusega seonduv RNA molekul, mis katalüüsib ensümaatilisi reaktsioone
Seda on võimalik saavutada erinevatel tasemetel.(2) DNA tasemel A) Funktsionaalse geeni inaktivatsioon in situ homoloogilisel rekombinatsioonil vastavalt muteeritud geenikoopiaga.(2) B) Oligonukleotiidide kasutamine. Teatud tingimustel võib DNA moodustada kolmekordse heeliksi. Selleks disainitakse geenispetsiifiline oligonukleotiid, mis paardub kindla sihtmärk geeni järjestusega kaheahelalises DNA-s ja inhibeerib selle geeni transkriptsiooni. Üheahelalise oligonukleotiidi seostumine kaheahelalise DNA-ga toimub nn. Hoogsteen'i paardumise kaudu (vesiniksidemed). Selliste sidemete puhul on kõige stabiilsemad G seondumine G-ga GC aluspaaris ja T seondumine A-ga AT aluspaaris.(2) RNA tasemel Antisense oligod või antisense geen, ribosüümid.(2) Valgu tasemel Polüpeptiidi funktsiooni inhibeerimine. Seda on tunduvalt vähem uuritud kui geeni eksi inpressioonhibeerimist DNA või RNA tasemel.(2) Eetilise probleemid Hirm inimese loodusliku olemuse kadumise pärast
sidemete abil ühe ja sihtmolekulini.Ensüüm ),enalapril(AKE)Geeni sama peptiidahela katalüüs:1.Katalüsaato kontroll:tuumas1.trans lähestikku osade r koorendab kriptsiooniline vahel.tertsiaar- reacts.,alandades kontroll,2.RNA protsessingu samast toimivad antisenss tasemel,3.RNA ahelast,ristseostavad 2 ravimid(oligonukleotiidi transpordi tasemel ahelat,seega d mRNA translatsiooni tsütoplasmas:translats blokeerides DNA blokeerides)See iooni,mRNA replikats,ja võimaldab blokeerida degradatsiooni transkripts,.Miinuseks kahjulikke valkude tasemel,posttranslatsio on see.et on väga sünteesi ning neil on oniline kontroll.DNA reaktiivsed ja võivad vähem KT.On
tootes lühikesevajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA fragmendist. 35.Polümeraas-ahelreaktsioon (PCR). PCR vajaminevad põhikomponendid. PCR põhietapid. Milleks kasutatakse PCRi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on eelnevalt vajalik teada uuritava DNA lõigu otste nukleotiidset järjestust, mille alusel disainida praimerid, mis on tavaliselt kuni 30 oligonukleotiidi pikkused. Reaktsioonis (PCRis) kasutatavad komponendid (maatriks DNA, praimerid, ensüüm ja vabad nukleotiidid) viiakse kohe algselt ühtebkatsutisse. PCR põhietapid on järgmised: 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikshelaks kõrge temperatuuriga (90-95C, 40-60 sek.). 2) praimerite seostamine (hübridiseerimine, anniilimine) DNA-le toimub tavaliselt temperatuuril 50-70C (ca 30 sek).
ettevalmistamise etappe! Millele tuleb tähelepanu pöörata ning mis võib põhjustada proovi halva kvaliteedi? DNA purustatakse, et saada fragmendid. Siis liidetakse neile mõlemasse otsa ühenukleotiidilised A otsad ehk adenüleeritakse ning siis ligeeritakse sinna külge adapter-oligonukleotiidid. Saadud fragmendid selekteeritakse suuruse järgi ja puhastatakse. Sellele järgneb klastrite genereerimine Flow-cell’is. Flow-cell põhjas on lühikesed oligonukleotiidi järjestused, mis on komplementaarsed DNAle liidetud adapteritega. DNA denatureeritakse üheahelaliseks ning liidetakse flow-celli põhjas olevatele oligonukleotiididele. Toimub sildamplifikatsiooni teke, mille tulemusel tekivad identsed DNA klastrid. Peale amplifikatsiooni DNA fragmendid denatureeritaske ja komplementaarsed ahelad pestakse, nii et järgi jäävad vaid ühest otsast kinnitatud DNA üksikahelad. Neile lisatakse
kaksikahelat. In vitro süntees: sünteesitud oligonukleotiidid on projekteeritud nii, et moodustada baaspaare, mille vahel on tühikud. Suurte geenide süntees: rohkem kui 1000bp. Kogu geeni võib moodustada mitmetest oligonukleotiididest, millest 4-6 on omavahel kattuvad (overlapping). Fill-in meetod over-lapping oligonucleotides: Kaks 60-80 mer oligonukleotiide võib sünteesida overlapping otstega. 19. Kirjelda detailselt, kuidas on võimalik, kasutades kahte kattuvat oligonukleotiidi ja fill-in meetodit, konstrueerida sünteetiline geen ning see kloonida, sekveneerida ja ekspresseerida E.colis. Kuidas erinevaid etappe analüüsitakse? Oligonukleotiide sünteesitakse keemiliselt nii, et nenda otsad kattuksid omavahel. Nii need oligonukleotiidsed ahelad seovad omavahel ning kasutades DNA polümeraasi I ja Klenow fragmenti, dNTP olemasolul võib sünteesida kaksikahelat. Seda sünteetilist järjestus
tunnevad ära värvusreaktsiooni katalüüsivate ensüümidega märgistatud antikehad. Meetodi piiranguks on RNA molekulide piiratud arv (10 000) rakus sellepärast amplifitseeritaksegi RNA hulk PCRil (tekib miljardeid koopjaid). [Seda meetodit nimetatakse GenProbe meetodiks] 5. Mis limiteerib GenProbe meetodi (hübridiseerimine) puhul testi tundlikkuse? Nukleiinhapete hübridiseerimine: amplifitseerimise korral nimetatakse oligonukleotiidi praimeriks, hübridiseerimisel sondiks. Ahelad keeratakse lahti ja kui on sondile komplementaarne järjestus, siis renaturatsiooni puhul see lühike sond seondub eelistatult DNA ahelaga, sest alati lühike nukleotiidi järjestus seondub pika ahelaga paremini kui kaks pikka ahelat omavahel. INNO-LIPA hübriidimise meetod: amplifitseeritakse DNA, kasutades biotiin-märget (biotinoleeritud
mutantsete valkude akkumulatsioonis bakteri membraanis. TUlemusena memrbaani barjäärifunktsioon häirub ning rakk lüüsub. EI seostu inimese 18S- rRNA-le, siis on toime selektiivne. mRNA kaudu toimivad ravimid Antisenss ravimid seisnevad oligonukleotiidide kasutamises mRNA translatsiooni takistamiseks. Probleemiks on asjaolu, et mRNA on suur molekul, millel on sek ja terts struktuur - raske leida järjestuslõike, mis on eksponeeritud, lisaks sellele oligonukleotiidi viimine rakku. Potentsiaal on suur. Esimene tuli turule 1992.a papilloomiviiruse põhjustatud genitaaltüügaste raviks. Nukleosiiditüüpi ravimid Ei ole algselt aktiivsed, kui peale fosforüleerimist trifosfaadiks võib inhibeerida pöördtranskriptaasi ning viiruse DNA sünteesi. AZT e zidovudiin/retrovir pürimidiinipõhine, AIDS-le, liitub kasvava DNA ahelaga, omades suhkrujäägi OH asemel N3 rühma, katkestab DNA ahela edasise kasvu.
mudel). DNA replikatsiooni initsiatsioon · spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide ori regioonide olemasoluga. vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees (praimerit on vaja selleks, et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots, kuhu DNA polümeraas saab liita nukleotiide). · Vajalik ka AT-rikas regioon ja teatud DNA järjestused Replikatsioon toimub interfaasis Praimer - uue ahela algus · Lühike oligonukleotiidi (DNA või RNA) järjestus, mis on komplementaarne DNA järjestusega. · Vajalik DNA ahela sünteesi alustamiseks, sest polümeraasil on vaja vaba 3'-OH otsa. DNA helikaas - Eraldab DNA ahelad teineteisest. DNA topoisomeraasid - katalüüsivad DNA ahelatesse ajutisi katkeid, et ei tekiks super- keerde. Superkeerd takistaks replikatsiooni jätkumist. Okazaki fragment - katkendlikult, lühikeste fragmentidena sünteesitav DNA
Koopiaarvu muutusi saab tuvastada ainult siis, kui rohkem kui 50% rakkudest sisaldavad kromosomaalseid muutusi. Ei saa identifitseerida kromosomaalseid ebanormaalsusi mis on tasakaalus. Langenud tundlikkus tänu test rakkude kontaminatsioonile normaalsete rakkude poolt. • SNP-kiibid – kasutatakse populatsiooni siseste polümorfismide detekteerimiseks. Kiip sisaldab immobiliseeritud alleel-spetsiifilisi oligonukleotiidi sonde. Fragmenteeritud proov märgistatakse fluorestseeruva märgisega ning detekteeritakse hübridisatsiooni signaali alusel. Saab töödelda tuhandeid proove madala kuluga Saab detekteerida haruldasi ja levinud CNVsid madala valede tulemuste tasemega kasutades viit sondi regiooni kohta. Kiire Vähi genoomi mosaiikne struktuur muudab CNVde tuvastamise keerulisemaks
edasikanduvad muutused, deletsioonid eemaldavad osa kromosoomist, inversioonid on kromosoomiosa ümberpööramised, translokatsioonid on mittehomoloogsete kromosoomide osade vahetumised. Üks näide. 5. kromosoomi lühikese õla osaline deletsioon tekitab Cri cu chat sündroomi. REPLIKATSIOON 1. Eukarüootne replikatsioon. Mehanism, läbiviivad ensüümid. Okazaki fragmentide rolli DNA replikatsioonil. Helikaas avab DNA ahelad, Pol /primaasi kompleks sünteesib praimeriks RNA oligonukleotiidi, Pol võtab DNA sünteesimise üle, juhtivahel sünteesitakse Pol poolt ühe lõiguna, mahajääv ahel Pol poolt Okazaki fragmentidena. Telomeraas on pöördtranskriptaas, mis pikendab telomeeridel olevaid kordusjärjestusi niipalju, et replikatsiooni käigus kromosoom ei lüheneks. DNA replikatsiooni origin'id on kohad kromosoomidel, kust alustatakse DNA sünteesi. DNA replikatsiooni eukarüootides iseloomustavad: palju replikatsiooni origin'e, millel üldjuhul puudub konsensus DNA
a K. Mullisele Nobeli preemia. PCR viiakse läbi biokee- milise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on eelnevalt vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust, mille alusel disainida praimerid, mis on tavaliselt kuni 30 oligonukleotiidi pikkused. PCRi käivitamiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidset väiksest arvust (kuni 30) nukleotiidist koosnevat praimerit (ingl. k. primer), mis kumbki vastavad ühe komplemen- taarse DNA ahela alguse nukleotiidsele järjestusele ja talitlevad kui ensüümi substraat, kuna neil on vabad otsad uute nukleotiidide sidumiseks. PCR pôhietapid on järgmised (vt ka joonis): 1) topeltahelalise DNA denaturatsioon kaheks üksikahelaks kôrge temperatuuriga (90-95 °C; 40-60 sek);
annaabi.ee 
