ELISA plaat 1 2 A L- L- 1:10 B L- L- 1:20 C L+ L+ 1:10 D L+ L+ 1:100 E M- M- 1:10 F M+ M+ 1:10 G PBS+Vii PBS r. H PBS PBS · Igasse süvendisse kanname 100µl proovi. · Taimelehest eraldame mahl spetsiaalse mahlapressi abil ja eppendorfi- tuubis lahjendame teda vajaliku kontsentratsioonini PBS-ga. Tuleb välja kaks proovi 1:10 ja 1:20, need on proovid ilma viiruseta. · Lehe proovi viirusega saame õppejõust. · Edasi valmistame mugulamatrejalist mugula proovi viirusega. Selleks võtame umbes 1g mugulat ja pressitakse välja mugula mahl, lahjendame teda PBS-ga vajaliku kontsentratsioonini. · Mugula proovi viiruseta saame õppejõust. · Kanname kõik proovid vastavasse süvenditesse
Sobiv keskkonna pH on 6. Töö käik. 1) Tööreaktiivi valmistamine (25 ml): (tööreaktiv on vajalik glükoosisisalduse määramiseks). - 2,5mg glükoosi oksüdaasi - 1,5 mg püroksüdaasi - 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0 - K4{Fe(CN)6} 0,1-list lahustkoguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks lõppmahuni. 2) Uuritava lahuse ettevalmistamine. Uuritavaks lahuseks kasutame mandariinimahle lahuse. Võtame 2-3ml mahla ja lahjendame (1:100) 3) Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks. - Glükoosi kontsentratsiooni uuritavas lahuses kindlaks teha, tuleb aluseks koostada koliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga lainepikkusel 410 nm. - Valmistame 3 kaliibrimislahuse: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml - Selle jaoks võtakse 3 puhast kolbi, ja samm-sammult lahjendamise meetodi kasutamisel
Töö käik: Meil on olemas ELISA plaat 16-ne süvenditega. Süvenditesse me kanname erinevate kontsentratsioonidega lehtede proovid viirusega või viiruseta. L- terve, L+ viirusega ELISA plaat 1 2 Igasse süvendisse kanname 100µl proovi. A L- L- 1:10 Taimelehest eraldame mahl spetsiaalse B L- L- 1:20 mahlapressi abil ja eppendorfi- tuubis C L- L- 1:50 lahjendame selle vajaliku D L- L- 1:10 kontsentratsioonini PBS-ga. 0 Plaadilt eemaldame mitteseostunud E L+ L+ 1:5 antigeeni ja peseme plaate 4x PBS/ Tw-ga F L+ L+ 1:10 G L+ L+ 1:50 ja 1x PBS- ga. H L+ L+ 1:10 Plaati blokeerime 1% BSA lahusega PBS/
Orgaaniliste lahustite (etanool, atsetoon jt) mõjul toimub valgu dehüdratiseerimine ning väljasadestumine. Sadesti ettevaatlikul lisamisel toimuv denaturatsioon on pöörduv ning sade lahustub vee lisamisel uuesti. Suuremas koguses lahusti lisamisel toimub pöördumatu denaturatsioon ning sade vee lisamisel ei lahustu. Töö käik: Katseklaasi valame 2 ml munavalgu lahust. Tilga kaupa ja segu pidevalt loksutades lisame orgaanilist solventi kuni sademe tekkimiseni. Seejärel lahjendame katseklaasi sisu veega ja jälgime, kas tekkinud sade lahustub või mitte. Tulemus: Lisades munavalgu lahusele atsetooni, tekib sade. Seejärel lahjendame veega, sade ei lahustu. Järeldus: Valguga toimus pöördumatu denaturatsioon. 1.2 Süsivesikute reaktsioonid Süsivesikud on ulatuslik ühendite rühm, kuhu kuuluvad suhkrud, aga ka tärklis, tselluloos ning mitmed teised polüoosid. Vastavalt struktuurile jaotatakse süsivesikud mono-, oligo- ja polüsahhariidideks.
ELISA plaat 1 2 A L- L- 1:5 B L- L- 1:20 C L- L- 1:50 D L- L- 1:100 E L+ L+ 1:5 F L+ L+ 1:20 G L+ L+ 1:50 H L+ L+ 1:100 · Igasse süvendisse kanname 100µl proovi. · Taimelehest eraldame mahla spetsiaalse mahlapressi abil, tsentrifuugime ja eppendorftuubis lahjendame selle vajaliku kontsentratsioonini PBS-ga. L- terve leht, L+ nakatunud. · Kanname kõik proovid vastavatesse süvenditesse ja jätame seisma üleöö 4 kraadi juurde. · Plaadilt eemaldame mitteseostunud antigeeni ja peseme plaate 4x PBS/ Tw-ga ja 1x PBS- ga shakeril. · Plaadi blokeerime 1% BSA lahusega PBS/ Tw-s 1h toatemperatuuril, eemaldame blokeeriva lahuse ja peseme 3x PBS/Tw-ga. · Plaadile kanname ensüümiga konjugeeritud antikeha, lahjendus 1:500
väärtusest, siis ei pruugi denatureerunud valk lahusest välja ei sadestuda. 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega Veega segunevad solvendid ( etanool, atsetoon jt.) põhjustavad valkude dehüdratiseerimist ja sadestavad neid lahusest välja. Sadesti sisalduse vähendamisel lahustub tekkinud sade uuesti. Töö käik: Katseklaasi valame 2ml munavalgu lahust. Tilgkaupa ja loksutades lisame orgaanilist solventi kuni sademe tekkimiseni (hägune sade). Seejärel lahjendame katseklaasi sisu veega mittemidagi ei juhtu, sade ei lahustu uuesti. Järeldus: Sade ei lahustu uuesti, sest toimus pöördumata denaturatsioon. Lisaks sellele see võib olla seotud sellega, et orgaaniline solvent oli lisatud kiiresti (aga mina olen kindel, et see ei ole nii). või suures koguses tekitab solvendi kõrge lokaalse kontsentratsiooni, võib toimuda valgu pöördumatu denaturatsioon ja sade ei lahustu enam täielikult. Süsivesinikute reaktsioonid
veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad esile valgu dehüdratiseerumise, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Töö käik: Katseklaasi valame 2 ml munavalgu lahust. Tilgakaupa ja segu pidevalt loksutades lisame orgaanilist solventi kuni sademe tekkimiseni. Seejärel lahjendame katseklaasi sisu veega ja jälgime, kas tekkinud sade lahustub või mitte. Tulemus: Lisades munavalgu lahusele atsetooni, tekib sade. Seejärel lahjendan veega, kuid sade ei lahustu ära. Toimus pöördumatu denaturatsioon. 1.2 Süsivesikute reaktsioonid Süsivesikud on arvukas bioloogiliste ühendite rühm, mis koosnevad ainult süsinikust, vesinikust ja hapnikust. Vastavalt struktuurile jaotatakse neid mono- , oligo- ja polüsahhariidideks
välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Töö käik: Katseklaasi valame 2ml munavalgu lahust. Tilgakaupa ja loksutades lisame orgaanilist solventi kuni sademe tekkimiseni (hägune sade). Seejärel lahjendame katseklaasi sisu veega. Tulemus: Sade jäi alles Järeldus: Sade ei lahustu uuesti, sest toimus pöördumatau denaturatsioon. Lisaks võib olla see seotud sellega, et orgaanilist solventi oli lisatud kiiresti või suures koguses, mis tekitab solvendi kõrge lokaalse kontsentratsiooni. Süsivesinikute reaktsioonid Süsivesikud on ulatuslik ühendite rühm. Organismides on süsivesikud energiaallikaks ja energeetiliseks varuaineks, taimedes selle kõrval ehitusmaterjalideks.
Töö reaktiivid: metüülpunane, vesinikkloriidhape, naatriumhüdroksiid Töö käik: 1. Leiame vajaliku naatriumhüdroksiidi koguse, eeldusega, et meil on vaja saada 0,25cm3 0,1M lahust: 1 liitris 0,1M lahuses on 0.1 mooli ainet. 0,25cm3 lahuses on 0,025 mooli ainet. M(NaOH)=40 g/mol Järelikult, 0,025 mooli kaal on 40*0,025 = 1g m(NaOH)= 1g 2. Lahustame 1g NaOH 50cm3 dest. vees 3. Jahtunult kallame saadud lahuse 250cm3 mõõtekolbi ning lahjendame dest. veega mõõtejooneni, sulgeme kolb korgiga ning hoolega loksutame lahust. 4. Saadud lahusest pipeteerime 25 cm3 koonilisse kolbi ning lisame sellesse sama palju dest. vett. 5. Saadud lahusesse lisame 3 tilka metüülpunast. 6. Büretti loputame ning täidame vesinikkloriidhappega. 7. Tiitrime naatriumhüdraksüüdi lhust 8. Määrame kulunud vesinikkloriidhappe kulunud kogus kui naatriumhüdroksüüdi lahus läks roosaks
annaabi.ee 
