kus Vv on graanutlitevahelise vedeliku maht, Vs graanulitesisese vedeliku maht ja Vg geelimaterjali ehk -maatriksi maht. Selleks, et uuritavaid aineid saaks läbi kolonni transportides üksteisest eraldada, tuleb kasutada sobivat voolutit ehk eluenti. Eluenti kogutakse aga kindla mahuga fraktsioonide kaupa (antud töös 2 ml). Elueerimismaht Vx on eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Liiga suured molekulid ei mahu graanulitesse ja väljuvad kolonnist esimesena, st nad on minimaalse elueerimismahuga ja on võrdsed graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vxmin = Vv Väiksed molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemini. Nad on maksimaalse elueerimismahuga on arvväärtuselt lähedased kolonni kogumahule. Vxmax = Vt Seda saab arvutada ka geelimaatriksi mahu abil
kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, Vxmax Vt. Geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: kolonni vaba mahtu Vv ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, Aine kontsentratsiooni eluaadi fraktsioonides ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks. Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerumis-mahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem. Töö käik:
Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületab kolonni kogumahu. Teades geelimaatriksi mahtu Vg, võib Vxmax arvutada: Vxmax = Vt - Vg Geelkromatograafiat iseloomustavad kaks olulist parameetrit: Vv(=Vxmin)- vaba maht e eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu; Vxmax - maksimaalne elueerimismaht, eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema. Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf. Rf = (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin) Aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nim. kromatogrammiks. Töö käik Kolonni iseloomustavad parameetrid: Kasutatav geel: Sephadex G-75 Geeli pundumisaste k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 17 Täidise diameeter d= 2,5; r = 1,25 Täidise kogumaht Vt= П*r2*L => 3,14* 1,252*17=83,41
Vxmax= Vt Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedeliku maht ületab kolonni kogumahu. Teades geelimaatriksi mahtu Vg, võib Vxmax arvutada: Vxmax= Vt-Vg Geelkromatograafiat iseloomustavad kaks olulist suurust: · Vv(=Vxmin)- vaba maht e. eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu · Vxmax- maksimaalne elueerimismaht, eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvus-teguriga Rf, mille väärtus jääb vahemikku 0...1. Rf= (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin) Aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nim. kromatogrammiks. Töö käik Kolonni iseloomustavad suurused Kasutatav geel Sefadex G-75 Pundumistegur k=0,1 Geelisamba kõrgus L= 29,5 cm Kolonni sisediameeter 2,1 cm ( r= 1,05 cm)
Kromatografeerimise protsessi võib lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud eluaadi üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kui geelimaatriksi maht on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu välja arvutada. Geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kolonni vaba mahtu (eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu) ja maksimaalset elueerimismahtu (eluaadi maht, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad). Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga . Kus . Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks. Näitena on toodud näidiskromatogramm
voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobivat vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on kaks olulist parameetrid: 1) kolonni vaba mahtu Vv (=Vxmin) ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu. 2) maksimaalset elueerimismahtu Vxmax ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja, mille elueerimismaht on kolonnis kindlaks määratud. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline sõltuvus. 2. Töö käik 1.3 Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Märkisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i margi ja seda
võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. Proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. Protsess viiakse läbi kolonnis, mis on täidetud pundunud geelikraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega. Geelikraanuli pooride suurust ületavate mõõtmetega molekulid ei saa graanulitesse tungida. Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad mahud -kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv), -graanulitesisese vedeliku maht (Vs), -geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg), -täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt). Seega: Vt=Vv+Vs+Vg Kui läbi kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest
arvutada. Vxmax = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: · kolonni vaba mahtu Vv (Vx min), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, · maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 < Rf < 1). Kromatogreerimissüsteem Tüüpiline kromatogeerimissüsteem koosneb
üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga.
Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu ka arvutada
Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja kaht parameetrit:
· kolonni vaba mahtu Vv ), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud
geeli pooridesse ei mahu
· maksimaalset elueerimismahtu , s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid,
mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad
LIIKUVUSTEGUR (Rf): ---> Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0...1 (0
arvutada. Vxmax = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: · kolonni vaba mahtu Vv (Vx min), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, · maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 < Rf < 1). Kromatogreerimissüsteem Tüüpiline kromatogeerimissüsteem koosneb
Plastokinoonses ahelas toimub ADP fosforüleerimine, mille juures moodustuv ATP kasutatakse CO2 assimilatsiooni süsteemis.) ja pikemalaineline P700 (moodustunud NADPH kasutatakse ära CO2 assimilatsiooni süsteemis). Need protsessid kulgevad kloroplastides. Fotokeemiliste reaktsioonide produktid ATP ja NADPH võimaldavad CO2 redutseerimist ja selle arvel orgaanilise aine sünteesi de novo. Fotokeemilised reaktsioonid on lokaliseeritud graanulitesse. Ensüümid, mis on seotud CO2 assimilatsiooniga, on stroomas. CO2 assimilatsiooni reaktsioonid moodustavad tsüklilise süsteemi reduktiivse pentoosfosfaatide tsükli e. Calvini tsükli. CO2 seotakse 5-süsinikulisele ribuloos 1,5-bisfosfaadi (RuBP) molekulile ensüümi RuBP karboksülaasi/oksügenaasi (Rubisco) osavõtul. Karboksüülimisreaktsiooni produktiks on kaks molekuli fosfoglütseriinhapet (PGA). Alternatiivselt võib Rubisco katalüüsida CO2 asemel O2 sidumist e
kusjuures proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. Segu geelkromatograafilise lahutamise põhimõte Geelkromatograafias viiakse protsess läbi kinnises süsteemis kolonnis (vt Kromatograafilised meetodid), mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega. Kuna geeligraanuli pooride suurust ületavate mõõtmetega molekulide tungimine graanulitesse on välistatud (inglise k excluded), siis siit ka nimetus eksklusioon- kromatograafia. 46 Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist (glükoosi polümeer, mida sünteesib bakter Leuconostoc mesenteroides), agaroosist (lineaarne punavetikate polüsahhariid, mis koosneb D-galaktoosist ja 3,6-anhüdro-L-galaktoosist) vi polüakrüülamiidist. Viimane on kopolümeer, mille akrüülamiidist (CH2=CH-CO-NH2)
annaabi.ee 
