● π-elektronide delokaliseeruvad rühmad on amino (-NH2 -NHCH3 , - N(CH3 )2 ,) -OH, -F, metoksü (-OCH3 ,). Need rühmad fluorestseeruvad. ● Molekuli jäikus soodustab fluorestsentsi kuna energiat ei ole nii lihtne enam võnkumistele ja keskkonna soojusele anda. ● Viskoossus soodustab fluorestsentsi, sest toimub vähem kokkupõrkeid ● Fenantreen, bensopüreen ja fluoreen fluorestseeruvad hästi, bifenüül ei fluorestseeru Pärssivad faktorid: 1. π-elektronide lokaliseeruvad rühmad on -Cl, -Br, -I, -HCOCH3 , -NO2 , -COOH. Neid gruppe sisaldavad ühendid ei fluorestseeru. 2. Lahustid, mille molekulid sisaldavad kustutavad molekuli fluorestsentsi: -Br, -I, -NO2, aga nad võivad suurendada fosforestsentsi. Antud funktsionaalsed rühmad indutseerivad magnetvälju, mis soodustavad tripletsesse olekusse üleminekuid (spinn pöördub kergemini) 3
Töö käik Kasutatud ergastamine lainepikkused on 230-400 nm ning emiteerimise lainepikkused on 250-615 nm. Mõõta tuli destilleeritud vee ja standardlahuste riboflaviin ning püridoksiin EEM spektrid. Tulemused: 1. Maksimumid: Destilleeritud vesi. Intensiivsus (maksimum): 132,6 Riboflaviin. Intensiivsuse maksimum: 4780,4.............................................................................. Püridoksiin. Intensiivsuse maksimum: 7418,9 Järeldused Destilleeritud vesi ei fluorestseeru, sest seal ei sisaldu flourestseeruvaid aineid. Saadav fluorestsentsspektraalkujund (SFS) kujutab ergastava valguse vee molekulidel mitteelastset hajumist ehk Ramani hajumist. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Riboflaviin fluorestseerub; püridoksiin fluorestseerub samuti ja peaaegu poole tugevamalt, kui riboflaviin. Riboflaviini intensiivsuse maksimum toimub ergastuslainepikkuses 365 nm ja emissioonilainepikkuses 530 nm. Püridoksiini intensiivsuse maksimum toimub ergastuslaine-
Salvestada andmed. Aine Konts, Ergastus, Emissioon, Intensiivsus mg/ml nm nm (max) 1. Destilleeritud vesi - 230 250 240,5 2. Riboflaviin 0,025 370,0 525,0 2579,0 3. Puridoksiin 0,022 325,0 390,0 4422,1 Tulemuste kirjeldus ja analüüs: Vesi ei fluorestseeru, EEM spektri maksimum on tingitud Ramani hajumisest. Puridoksiin ergastub ja emiteerib footoneid lühematel lainepikkustel (võrreldes riboflaviiniga) ning selle fluorestsents on intensiivsem. Ramani hajumine Joonis 1. Destilleeritud vee EEM spekter Joonis 2. Riboflaviini EEM spekter Joonis 3. Puridoksiini EEM spekter 3.2 Uurimine, kas aine fluorestsents sõltub keskkonna pH-st (püridoksiini ja
ergastamiseks kasutatud footon. Seetõttu on ainest kiiratud valgus pikema lainepikkusega kui tema ergastamiseks kasutatud valguskiirgus. Nende lainepikkuste erinevust nimetatakse Stokesi nihkeks. Jablonski diagramm: 2 Derivatsireerimine: ehk funktsionaalrühma modifitseerimine- on võte, kus keemilise ühendi funktsionaalrühm asendatakse teise rühmaga. Kasutatakse näiteks siis kui lähteaine ei fluorestseeru, sel juhul viiakse sisse rühm, mis fluoretseerub. Samuti võib olla see vajalik aine polaarsuse, lenduvuse muutmiseks või stabiliseerimiseks. Orgaanilses keemias kasutatakse sama võtet mingi rühma kaitsmiseks hilisemateks reaktsioonideks. Fluoresentsi kustutamine: Kui relaktseerumine toimub mingi teise molekuli mõju tõttu. Toimib tavaliselt näiteks O2 või raskemetallide juuresolekul. 3 Aparatuur:
Kolmandal korral mdetakse emissiooni maksimaalsel ergastusel. Luminestsentsi phjustavad struktuursed faktorid. Molekul peab sisaldama konjugeeritud kaksiksidemeid, millega kaasneb -elektronide delokalisatsioon ja nende vime ergastuda. -elektrone delokaliseerivad rühmad: -NH2, -OH, -F, -OCH3, -NHCH3, -N(CH3)2. Neid gruppe sisaldavad molekulid fluorestseeruvad. -elektrone lokaliseerivad rühmad: -Cl, -Br, -I, -NHCOCH3, - NO2, -COOH. Neid gruppe sisaldavad molekulid ei fluorestseeru. Aniliin fluorestseerub, nitrobenseen mitte. Molekuli jäikus suurendab fluorestsentsi, kuna energiat ei ole nii lihtne enam vnkumistele ja keskonna soojusele anda (prkumised teiste molekulidega). Viskoosus suurendab fluorestsentsi. Lahusti mju. Lahustid millede molekulid sisaldavad -Br, -I, - NO2, -NN-, kustutavad proovi molekulide fluorestsentsi, kuid vivad suurendada fosforestsentsi. Antud funktsionaalsed rühmad indutseerivad magnetvälju, mis soodustavad
tasemeni. Seejärel eemaldatakse plaat voolutuskambrist, lastakse kuivada ja märgitakse pliiatsiga indikaatorlaikude keskpunktid. Kui tegemist ei ole värviliste ainetega, osutub vajalikuks indikaatorlaikud visualiseerimine. Olenevalt ainest, tuleb indikaatorlaikude visualiseerimiseks kasutada erinevaid meetodeid. Kui lahutatud ained UV-kiirguses fluorestseeruvad, võib nende asukohad kindlaks teha UV-lambi abil. Kui aga lahutatud ained ei fluorestseeru, võib kasutada spetsiaalseid UV-kiirguses fluorestseeruvaid kromatograafilisi plaate. Sellisel juhul jäävad indikaatorlaigud UV-lambi all nähtavaks tumedate aladena üldisel fluorestseeruval taustal (plaadil). Teatud ained muutuvad kromatogrammil tumedate laikudena nähtavaks joodikambris ilmutamisel. Ideaaljuhul on kõik segu komponendid ruumiliselt lahutatud ja paiknevad kromatogrammil selgepiiriliste väikeste laikudena. Jaotuskoefitsient, Rf (retention factor)
141. Fluorestsents - aine omadus emiteerida valgust pärast ergastamist kindla lainepikkusega kiirgisega. Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. 142. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. 143. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, asmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid
umbes 50%. Aga kuna signaal on, saab järjeldada, et plasmiidid on raku sees ja tranfekteerimine õnnestus. Rakkude immuunotsütokeemiline värvimine Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. • Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt • Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis
2% söödud toksiinist (Fink-Gremmels, 2008). USAs järelvalvetegevuse raames testitud farmipiimaproovidest 3,9% ja piimatööstuste proovidest 0,4% on sisaldanud aflatoksiini üle USA lubatud taseme (Whitlow, 2006) (mis muide on 10 korda suurem kui lubatud tase Euroopa Liidus). Kui varem arvati, et vatsa mikrofloora metaboliit aflatoksikool piima ei eritu, siis pärast uute meetodite kasutuselevõttu, mis detekteerivad ka aineid, mis ei fluorestseeru, on soovitatud alustada ka aflatoksikooli montooringuga piimas. Uuring Mehhikos aastatel 1996-1998 leidis aflatoksikooli üle 0,05 g/kg 13% ja üle 0,5 g/kg 8% pastöriseeritud piima proovides. Maksimaalsed detekteeritud aflatoksikoolikogused turustatava piima proovides on ulatunud 12,4 g/kg . Paljudes riikides kehtivad piima lubatud aflatoksiin M1 konsentratsioonile limiidid ning paljud teadlased on püüdnud leida mudeleid, mille alusel saaks arvutada toksiinikogused söödas, mille
taustaneeldumisest olla kaks korda kõrgem. Mõõdame neeldumist kõrgel taustal ehk läbilastava valguse taustal. Mõõdame väikest muutust suurel taustal. On vähem tundlik, aga lollikindlam. Eeliseks on see, et kui teame mingi aine ekstensioonikoefitsienti (kirjandusest jne), siis saab laboris kasutada. Fluoromeetria exOem neelates valguskvanti ühel lainepikkuse, molekul ergastub, jõuab kõrgema energiaga nivoole, sest sai kvandienergia juurde. Kõik, mis neelavad, need ei fluorestseeru. Fluorestsents on erijuht, kus osa energiast antakse tagasi valguskvandina, osa läheb aga soojuseks (osa energiast läheb kaduma seega). ex väiksem kui em, ex on ergastus, em on emissioon. Ergastuslainepikkus on alati madalam emissioonilainepikkus. Mida väiksem lainepikkus, seda kõrgem on energia". Eeliseks on see, et me mõõdame täisnurga all fluorestsentsi fluoromeetria puhul me mõõdame väikest muutust pimedal taustal, tausta pm pole. Emissioonivalgus läheb igasse
annaabi.ee 
