Agranulaarsed on monotsüüdid ja lümfotsüüdid. 2 nädal. 1. Rakutsükkel (RT) a. Mis asi see on Raku eluperiood ühest jagunemisest teiseni. b. RT faasid M-faas (ProMeAnTel) ja Interfaas (G1, S, G2) c. DNA hulga muutus RT käigus G1 -2n; S 2n->4n, G2 -4n; M 4n->2n 2. DNA värvid a. Milliseid on Etiidiumbromiid, DAPI jne. Positiivse laenguga. b. Fluorestsentsi intensiivsuse sõltuvus DNA hulgast Mida rohkem on DNA-d, seda intensiivsem on fluoresents. 3. RT tuvastamise võimalused a. Kõikide võimaluste eelised ja puudused Fluoressents - aeglane, ebatäpne. Aga näed ise oma silmaga Läbivoolutsütomeetria masin (peab vaid lootma, et ei valeta), kiire, konkreetne. 4. Läbivoolutsütomeetria
Veetustamine, rasve eemaldamine, parafiini sisestamine, deparafiniseerimine. VÄRVAINED! - Hematoksüliin aluseline värv, mis värvib rakkudes happelisi piirkondi (DNA, RNA) - Eosiin on fluorestseiini derivaat. Happeline värv, mis värvib rakus aluselisi piirkondi (tsütoplasma). - Trüpaansinine happeline värv, mis läbib surnud rakkude kahjustunud plasmamembraani ning värvib tsütoplasma valke. - Propiidiumjodiid ja etiidiumbromiid pos laetud fluorestseeruvad ained, mis läbivad surnud rakkude kahjustunud plasmamembraani ja värvivad nukleiinhappeid (DNA, RNA). Seostuvad aluspaaride vahele, mille järel nende fluorestsents tõuseb ligi 30 korda. - DAPI DNA - Hoechst ka DAPI värvivad surnud ja elus rakke, Hoechst rohkem.
õhukindlalt suletavat konteinerit. * Kokku puutunud prahti käideldakse ohtlike jäätmetena. Akrüülamiid, teised kahe komponendiga polümeerid ja naatrium dodetsüülsulfaat (SDS) * Ära kunagi puutu neid ühendeid otseselt. Pulbri kaalumisel kasuta alati kindaid, soovitavalt ka kaitseprille ning suukaitset. Kaalu alati tõmbe all. Fenool * Fenooli nahale sattumise oht on võrdlemisi suur, aga sügelusega kergesti märgatav ning veega mahapestav. Etiidiumbromiid * EtBr läheb latekskindast läbi, aga nitriilkindast mitte. * Geeli mitte kätega puutuda. * Ruumid, kus asub geelipildistamise aparatuur, tuleb lugeda EtBr-ga saastunuks. 2. Mis on zoonoosid? Milliseid zoonoose on kõige tõenäolisem saada laboris töötades. Miks? Zoonoosid- A-tüüpi salmonelloosid. 3. Millised on olulisemad infektsioonid, mis ohustavad töötamisel inimorganismi kudede ja kehavedelikega? HIV, hepatiidid(b, c, d), süüfilis. 4
õhukindlalt suletavat konteinerit. * Kokku puutunud prahti käideldakse ohtlike jäätmetena. Akrüülamiid, teised kahe komponendiga polümeerid ja naatrium dodetsüülsulfaat (SDS) * Ära kunagi puutu neid ühendeid otseselt. Pulbri kaalumisel kasuta alati kindaid, soovitavalt ka kaitseprille ning suukaitset. Kaalu alati tõmbe all. Fenool * Fenooli nahale sattumise oht on võrdlemisi suur, aga sügelusega kergesti märgatav ning veega mahapestav. Etiidiumbromiid * EtBr läheb latekskindast läbi, aga nitriilkindast mitte. * Geeli mitte kätega puutuda. * Ruumid, kus asub geelipildistamise aparatuur, tuleb lugeda EtBr-ga saastunuks. 222 Mida tuleb silmas pidada, kasutades laboris mikrolaineahju? Mikrolaineahju ei tohi panna sööki/jooki. Seda tuleb puhastada. Lahuse asetamisel ahju tuleks teada, kaua protsess u aega võtab, et ei tekiks nn plahvatus või ülekeemisohtu. 222 Millised bioloogiliste ohutegurite ohurühmad on kirjeldatud Eestis
suletavat konteinerit. * Kokku puutunud prahti käideldakse ohtlike jäätmetena. Akrüülamiid, teised kahe komponendiga polümeerid ja naatrium dodetsüülsulfaat (SDS) * Ära kunagi puutu neid ühendeid otseselt. Pulbri kaalumisel kasuta alati kindaid, soovitavalt ka kaitseprille ning suukaitset. Kaalu alati tõmbe all. Fenool * Fenooli nahale sattumise oht on võrdlemisi suur, aga sügelusega kergesti märgatav ning veega mahapestav. Etiidiumbromiid * EtBr läheb latekskindast läbi, aga nitriilkindast mitte. * Geeli mitte kätega puutuda. * Ruumid, kus asub geelipildistamise aparatuur, tuleb lugeda EtBr-ga saastunuks. 2. Mis on zoonoosid? Milliseid zoonoose on kõige tõenäolisem saada laboris töötades. Miks? (siin vastus. A-tüüpilised sallmonelloosid. Kuid miks, uuri ise). on mets- ja koduloomade nakkushaigused, mis võivad nakatada inimest, või ka vastupidi: inimesed võivad nakatada loomi.
Faaskontrastmikroskoobi töö põhimõte. Valguslaine faas muutub kui valgus läbib elusa raku Mikrotoomi töö põhimõte. Fluorestsentsmikroskoobi töö põhimõte. Fluorestseeruvate värvide ergastus ja emissiooni lainepikkuste erinevus. Elavhõbeda lamp ergastab kiirguse Ergastuse lainepikkus on alati kõrgem kui emissiooni lainepikkus Tsütoloogias kasutatavad värvid hematoksüliin, eosiin ja trüpaansinine. Fluorestseeruvad värvid propiidiumjodiid ja etiidiumbromiid. Hematoksüliin(happeline piirkond DNA, RNA), eosiin (aluseline- tsütoplasma), trüptaansinine- happeline värv,läbib surnud rakkude kahjustunud plasmamebranne javärvib tsütoplasma valke Propiidiumjodiid ja etiidiumbromiid-positiivselt laetud fluorestseeruvad ained, mis läbivad surnud rakkude kahjustatud plasmamembraani ning värvivad nukleiinhappeid (DNA, RNA). Seostuvad aluspaaride vahele, mille järel nende fluorestsents tõuseb ligi 30 korda. Neeldumis
ja see tapab rakud kõrgete dooside korral. UV (254-260 nm) põhjustab puriinide ja pürimidiinide dimeeride teket ja sellega ebanormaalseid DNA ahelaid. Keemilised mutageenid - aluste analoogid on sarnased lämmastikalustega ja need inkorporeeritakse replikatsioonil DNAsse. Mõned neist põhjustavad vale paardumist (5- broomuratsiil). Aluseid modifitseerivad ained: deamineerivad, hüdroksüleerivad, alküleerivad. Interkaleerivad ained: hüdrofoobsed molekulid nagu proflaviin, etiidiumbromiid, lähevad aluste vahele ja seovad endaga replikatsioonil uue aluse (insertsioon). Kui nad aga eemaldada, siis võtavad aluse kaasa (deletsioon). Sait-spetsiifiline in vitro mutagenees on meetod, milles mutantne alleel sünteesitakse ja viiakse rakkudesse või katseloomadesse. Inimese geenide ja mutatsioonide uurimisel oluline meetod. DNA reparatsioon: Ensümaatilised reparatsioonisüsteemid, mis takistavad ja parandavad tekkinud mutatsioone DNA aheals
140. DNA - markeri kasutus Kui tahetakse teada uuritava DNA fragmendi pikkust, lisatakse geeli ühele „rajale“ ka segu kindla meile teadaoleva pikkusega DNA fragmentidest, nn DNA marker. Kõrvutades oma proovi meile teadaoleva pikkusega vöötidega, saame selle kaudu tuletada ligikaudse fragmendi pikkuse. 141. DNA visualiseerimine geelil Kuigi geelis olev DNA on palja silmaga nähtamatu, on võimalik seda teatud keemiliste ühenditega nähtavaks muuta. Kõige levinumaks ühendiks on etiidiumbromiid, mis seostub kaheahelalise DNA molekuliga ning kompleksis sellega helendab ultraviolettvalguse käes. PIIRSOO OSA Loeng 2. Rakkude proliferatsioon, rakutsükkel ja selle regulatsioon 1.Rakutsükkel ja rakutsükli faasid Rakutsükkel – raku eluring mitoosi lõpust läbi interfaasi järgmise mitoosi lõpuni. Faasid: G1 - postmitootiline e presünteetiline period interfaasis, rakk kasvab, toodab ekskretoorseid aineid. S – DNA - replikatsioon, kromosoomivalkude süntees ja tsentrosoomi
toatemperatuuril destilleeritud vees. • Polüakrüülamiidgeelide hõbetamist. See on tehniliselt keerulisem kui EtBr-ga värvimine, kuid samas tundlikum. Geelelektroforeesi protokoll MATERJALID JA APARATUUR PUHVRID JA LAHUSED. • Agaroosgeel saadakse agaroosi kuumutamisel koos puhvriga, kuni lahus on selge ja läbipaistev. Seejärel valatakse agaroosilahus geelialusele ja lastakse tarduda. • Elektroforeesipuhver (tavaliselt 1× TAE või 0,5× TBE). • Etiidiumbromiid, • Geeli pealekandmispuhver (gel loading dye) MOLEKULMASSI MARKER. • DNA suurusmarker (size standard). Teadaoleva suurusega DNA proovid saadakse tavaliselt plasmiidi või bakteriofaagi DNA lõikamisel restriktsiooniensüümidega. Hea oleks omada nii kõrgmolekulaarmassiga 1 kb - >20 kb fragmendi pikkusega standardit kui ka madala molekulaarmassiga 100-1000 bp fragmendi pikkusega standardit. PCR PRODUKT, mis saadi eelmises praktikumis Protseduur: 1
sagedus kasvab. Lämmastikaluste analoogid petavad nukleotiide, sünteesivad ensüümid ära. DNA-sse läheb modifitseeritud lämmastikalus või mõni muu ühend. Moodsa keemia areng – palju ühendeid, mida tarbitakse on lämmastikalused või nende derivaadid. Vahel satuvad DNA koostisesse. nt 5-bromouratsiil, mis võib teha aluspaari G-ga ja sellega tekitada valepaardumise DNA-s. Tsüklilised aluselised ühendid tekitavad DNA-s ebaregulaarse struktuuri. Etiidiumbromiid on üks oluline kemikaal, mida kasutatakse DNA värvimiseks. Helendab DNA-d UV valguses – muudab oranžikaks. Ise kovalentselt ei reageeri, tekitavad ebaregulaarseid struktuure. DNA kõrgemat järku struktuuri modifitseerimine. Reparatsiooni käigus toimub DNA lagundamine ja süntees. Osalevad paljud samad ensüümid mis replikatsiooniski DNA reparatsioonisüsteemid: Tüüp ⁞ viga ⁞ ensüümid: 1) valepaardumine ⁞ replikatsiooni viga ⁞ MutS, MutH, MutL
annaabi.ee 
