DNP-aspartaadil ning müoglobiini molekulmass jääb nende ainete vahele. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx min = Vv = 17,5 ml Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 23,5 ml Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx max = 46,5 ml Võrdlen viimasena väljunud komponendi elueerimismahtu arvutusliku Vx max väärtusega. Kui töö on korrektselt läbi viidud, peaksid need kokku langema. Vx max = 46,5 ml Vx max arvutuslik= 46,1 ml (46,143 ml) Arvud on päris sarnased, seega võin lugeda töö õnnestunuks. Arvutan liikuvusteguri Rf väärtuse segus sisaldunud valgu jaoks, kasutades arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vx max väärtust. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Rf= (23,5 17,5) / (46,1 17,5) = 0,21
Küllalt väikse molekulmassiga ained, mis täielikult difundeerub geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, Vxmax Vt. Geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: kolonni vaba mahtu Vv ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, Aine kontsentratsiooni eluaadi fraktsioonides ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks. Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavad nende
Kõige viimasena väljuvad kolonnist need molekulid, mille molekulmass on väike ja mis mahuvad geeli pooridesse. Nende molekulide elueerimismaht on maksimaalne ja lähedane kasutatava kolonni kogumahule. Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui väljunud fraktsioonide maht võrdub kolonni kogumahuga. Kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte parameetrit: kolonni vaba mahtu (eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis geeli pooridesse ei mahu) ja maksimaalset elueerimismahtu ( eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid mis geeli pooridesse täielikult sisenevad). Kromatogrammiks nimetatakse eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja mahu vahelist graafikut. Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja fraktsioonikogurist. Tihti on kasutusel automaatkolonnid, mis automaatselt lisavad kolonni eluenti, antud töös on aga kasutusel klaaskolonnid, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex G - 75
milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule V t. Vxmax = Vt. Kromatografeerimise protsess on lõppenud, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib arvutada maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt Vg Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kolonni vaba mahtu Vv (= Vxmin) ja maksimaalset elueerimismahtu Vxmax. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = (Vx Vxmin) / (Vxmax Vxmin) Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1. Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks. Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerumismahud, milles vastava
arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule . Kromatografeerimise protsessi võib lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud eluaadi üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kui geelimaatriksi maht on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu välja arvutada. Geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kolonni vaba mahtu (eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu) ja maksimaalset elueerimismahtu (eluaadi maht, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad). Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga . Kus . Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks.
Et uuritavat ainet läbi kolonni transportida ja, et erinevad molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobivat vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on kaks olulist parameetrid: 1) kolonni vaba mahtu Vv (=Vxmin) ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu. 2) maksimaalset elueerimismahtu Vxmax ehk eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Liikuvusteguriga Rf iseloomustatakse aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja, mille elueerimismaht on kolonnis kindlaks määratud. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline sõltuvus. 2. Töö käik 1.3 Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine
Järgmisena väljus kolonnist müoglobiin (teine kõver kromatogrammil) Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx=32+24=56ml. Kolmandana väljus DNP-aspartaat (kolmas kõver) ning see on kõige väiksema molekulmassiga aine, ta difundeerus kõige rohkem geeli pooridesse, väljus maksimaalse elueerimismahuga. Eluaadi maht DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni:Vx;max= 56+34=90ml. D. Viimasena väljunud komponendi elueerimismahtu võrreldakse arvutusliku Vx;max väärtusega. Arvutuslikult sain, et Vx;max=95.4ml. Katse tulemusel sain aga 90 ml. On näha, et need on natukene erinevad. Arvatavasti on põhjus ebatäpses fraktsioonide kogumises või viimaste fraktsioonide kogumatajätmises,kuna silmaga vaadates enam värvi ei paistnud. E.Leian liikuvusteguri Rf väärtuse segus sisaldunud valkude jaoks, kasutades Rf arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vxmax väärtust. Rf=(Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)= (56ml-32ml)/(95
Vx max Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vxmax = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: · kolonni vaba mahtu Vv (Vx min), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, · maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 < Rf < 1).
Kromatografeerimise protsess on lõpetatud, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi)
üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga.
Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu ka arvutada
Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja kaht parameetrit:
· kolonni vaba mahtu Vv ), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud
geeli pooridesse ei mahu
· maksimaalset elueerimismahtu , s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid,
mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad
LIIKUVUSTEGUR (Rf): ---> Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0...1 (0
Vx max Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vxmax = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: · kolonni vaba mahtu Vv (Vx min), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, · maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 < Rf < 1).
Vxmax Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vx max = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: ¾ kolonni vaba mahtu Vv (= Vxmin), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, ¾ maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vx min Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 < Rf < 1)
annaabi.ee 
