Saadud fragmendid selekteeritakse suuruse järgi ja puhastatakse. Sellele järgneb klastrite genereerimine Flow-cell’is. Flow-cell põhjas on lühikesed oligonukleotiidi järjestused, mis on komplementaarsed DNAle liidetud adapteritega. DNA denatureeritakse üheahelaliseks ning liidetakse flow-celli põhjas olevatele oligonukleotiididele. Toimub sildamplifikatsiooni teke, mille tulemusel tekivad identsed DNA klastrid. Peale amplifikatsiooni DNA fragmendid denatureeritaske ja komplementaarsed ahelad pestakse, nii et järgi jäävad vaid ühest otsast kinnitatud DNA üksikahelad. Neile lisatakse sekveneerimispraimerid mis on komplementaarsed DNA otsas olevate oligonukleotiididega. Nüüd on DNA valmis sekveneerimiseks. 18. Mille jaoks kasutatakse järgmise põlvkonna (Sangeri meetod on siin esimene põlvkond) sekveneerimist? Too näide mõnest projektist.
· E6 inaktiveerib p53 p53 degradatsioon, E7 kaudu onkogeen aktiveeritakse inaktiveerib pRB, transkriptsioonifaktor E2F kromosoomides toimunud translokatsiooni tõttu vabaneb ja hakkab valke tootma. · Aktivatsioon geenide amplifikatsiooni kaudu 4. Onkogeenide funktsioonid tekib mingi geeni üleekspressioon, nt. HER2 · Soodustavad proliferatsiooni, takistavad üleekspressioon diferentseerumist, inhibeerivad apoptoosi · Retroviiruste induktsioon viiruse valgud
kutsu. Kuna proto-onkogeenid on normaalsed raku geenid, mis kodeerivad rakkude kasvus ja jagunemises olulisi valke, peab nende osalus onkogeneesis olema põhjustatud näiteks mutatsioonist. (Kas somaatiline mutatsioon, mille läbi üks või teine proto-onkogeen aktiveeritakse, on kasvaja moodustumise seisukohalt esmane või eelneb sellele teisi muutusi DNA tasemel, pole veel päris selge.) Protoonkogeenide aktivatsioon võib toimuda punktmutatsiooni, kromosoomiaberratsiooni või amplifikatsiooni läbi. Proto-onkogeen võib konverteeruda onkogeeniks translokatsiooni, deletsiooni, inversiooni või duplikatsiooni läbi. Senini on kasvajates kirjeldatud üle saja erineva retsiprookse translokatsiooni, millede murrukohtade geenide kloneerimine on paljudel juhtudel viinud vähi tekkel osalevate geenide identifitseerimisele. Translokatsiooni või inversiooni tagajärjel võivad proto- onkogeenid aktiveeruda tänu asetumisele antud rakus aktiivse promootori või enhanseri kõrvale.
Problems · Short-lived nature of gene therapy · Immune response · Problems with viral vectors · Multigene disorders Geneetiliste haiguste diagnostika- probleemid ja võimalused Geneetilise diagnostika eesmärk Pakkuda infot molekulaartasemel mis ühendades patsiendi sümptomite, kliinilise pildi ja ajalooga võimaldaksid täpsemat ja tundlikumat haiguse diagnoosi ja võimalusel vihjeid efektiivsete ravivõtete kohta Testid · Amplifikatsiooni põhised · Hübridisatsioonil baseeruvad · Elektroforeetilised meetodid · Array/kiibi tehnoloogiad · Sekveneerimine Võimalused · Preimplatatsiooni ja loote uuringutel võimalus vältida raskeid geneetilis haigusi · Presümptomaatilise diagnostika abil riskigruppidel võimalik käitumist muuta · Pere planeerimisel võimalik geneetilist tausta arvesse võtta Euroopa ja USA strateegiad GMO taimede osas erinevused ja saavutused
renaturatsiooni puhul see lühike sond seondub eelistatult DNA ahelaga, sest alati lühike nukleotiidi järjestus seondub pika ahelaga paremini kui kaks pikka ahelat omavahel. INNO-LIPA hübriidimise meetod: amplifitseeritakse DNA, kasutades biotiin-märget (biotinoleeritud nukleotiidid), mis seob streptavidiini tekkiv kompleks on üks tugevamaid bioloogilisi interaktsioone. Streptavidiini küljes on veel fosfataas värvireaktsiooni läbi viimiseks. Peale amplifikatsiooni viiakse see kõik testribale, kus iga triip vastab ühele järjestusele. Hübridisatsiooni korral tekib värvireaktsioon. *Sondi pikkus (mida lühem sond, seda suurem võimalus leida temale vastavaid sama lühikesi järjestusi erineva järjestusega pikemate järjestuste seast). *Nukleiinhape puhtus *Nukleiinhappe kogus * 6. Kuidas tuleks korraldada seroloogilist testimist kui antud nakkuse puhul on seropositiivsus laialt levinud nähtus?
Siin asub arhiiv proovimaterjalist eraldatud DNA säilitatakse 1 aasta laborikoodide alusel Masinaruum Masinaruumis toimub liigispetsiifilise märklaud DNA paljundamine Nested-PCR korral pannakse proov nn. Kaks korda masinasse, et omakorda võimendada PCR signaali Foreesiruum · Viimane ruum, siin analüüsitakse PCR tulemusi · Tuubid avatakse, kantakse reaktsiooniprodukt agaroosgeelile · Suuremad DNA produktid jooksevad aeglasemalt, väiksemad kiiremini produktide lahutamine · DNA amplifikatsiooni produkt tehakse nähtavaks UV valguses, tulemus pildistatakse Külmkapp: · Defineerida, mis temperatuuril peab olema · Igapäevane kontroll termomeetriga, mis on kalibreeritud referentstermomeetri vastu. Temp. Näitu vaadates tuleb võttes arvesse parandit. Üldtõed · Iga etapp analüüsi käigus peab olema kontrollitud ja dokumenteeritud! Kirja, millise lot nr. kemikaali kasutati, mis kell ja kes viis analüüsi läbi. · Töö kindla reeglistiku järgi - töökirjeldused
(lisatuna keemia-ja/või hormoonravile) bioloogilist ravi. (MOVET 2011) HER2 staatust määratakse operatsioonil või biopsiaga võetud koetükist. Kasutusel on kaht tüüpi HER2 testimise meetodit. IHC (immunohistokeemia) meetodit kasutatakse liigse HER2 valgu (üleekspressiooni) määramiseks rinnavähi koes. CISH või FISH (kromogeenne või fluorestsents In situ hübridisatsioon) meetodit kasutatakse liigse HER2-geenikoopiate (amplifikatsiooni) määramiseks. (HER2... 2011) 22 3.2.7. Lisauuringud Kõrge rinnavähiriskiga naiste puhul kasutatakse ka geneetilist sõeluuringut selle uuringu eesmärgiks on leida muutusi rinnavähi geenides. Selleks tehakse enamasti vere analüüs või uuritakse mingi organi või koe tükikest. Uuring on kallis ja ei ole veel laialdaselt kättesaadav.
Selle onkogeeni olemasolu on tuvastatud paljude kasvajatüüpide puhul – rinnavähk, põievähk, B - rakuline leukeemia, melanoom jne. E2F on transkriptsioonifaktor, kui selle geeni aktiivsus on pärsitud, siis hakkavad rakud kontrollimatult prolifereeruma. 13. Onkogeenide ja tuumori suppressorgeenide aktivatsiooniteed - mehhanismid: a. Aktivatsioon mutatsioonide kaudu b . Aktivatsioon kromosoomide translokatsiooni kaudu c. Aktivatsioon geenide amplifikatsiooni kaudu d. Aktivatsioon retroviiruste abil - Aktivatsioon mutatsioonide kaudu – näiteks muteerub normaalne proto - onkogeeni ras geen – tekib 1 nukleotiidi asendus ning tekib mutantne ras, mis on hüperaktiivne ning aktiveerib signaaliteed. - Aktivatsioon kromosoomide translokatsiooni kaudu – Myc protoonkogeeni valgu süntees on oluliselt tõusnud translokatsiooniga Burkitt´ I lümfoomi B lümfotsüütides – translokatsioon t(8;14)
määramisega rifampitsiini suhtes Poolkvantitatiivne astmeline reaalaja PCR (GeneXpert MTB/RIF), mis võimaldab: • M.tuberculosis’e kompleksi DNA tuvastamist rögast või selle kontsentreeritud sademest • rpoB geenis rifampitsiini resitentsusega seotud mutatsioonide tuvastamist Meetod on ette nähtud ravimata tuberkuloosikahtlusega patsientidel. GeneXpert süsteem ühendab ja automatiseerib proovi töötluse, nukleiinhapete amplifikatsiooni ja märklaud-järjestuste tuvastamise. GAMMAINTERFEROON (P-M TUBERCULOSIS γINF) TEST. Immuunvastusena toodetud gammainterferooni hulk on suurem (positiivne) patsiendi varasema kokkupuute korral M.tuberculosis’e peptiidsete antigeenidega ning väiksem (negatiivne), kui tuberkuloosibakteritega varasem kokkupuude puudub. Mükobakteriooside mikrobioloogiline diagnostika Atüüpiliste mükobakterite ühekordne isoleerimine ei pruugi omada kliinilist tähendust, vaid võib olla
annaabi.ee 
