· 5 minuti pärast võtsin sama pipetiga uuesti 3 ml reaktsioonisegu ning viisin selle teise TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi, loksutasin ja sama operatsiooni kordasin 5- minutiliste intervallidega veel 2 korda Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine · proovidega katseklaasid jätsin täielikuks sademe formeerumiseks 10-15 minutiks seisma ning samal ajal panin valmis 4 kuiva ja puhast katseklaasi ja varustasin need plastlehtrite ja paberfiltritega · proovid, mille sade oli settinud, filtrisin kuivadesse katseklaasidesse · spektrofotomeetril määrasin nelja, erineval ajal reaktsioonisegudest võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel 280 nm · kaliibrimisgraafikult leidsin vastavalt proovide optiliste tiheduste väärtustele neis sisalduva türosiini kontsentratsioonid
lahjendusmäära saavutamiseks vajalik kogus puhvrit. Katseklaasi lisasin 0,5 ml invertiini lahust ja 9,5 ml atsetaati, et saavutada 20 kordne lahjendus. · Katseklaasi sulgesin korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine. · Võtsin 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7%- line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. · Katseklaasi varustasin korgiga ja asetasin umbes 5 10 minutiks vesitermostaati juurde soojenema. · Võtsin 3 koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Komplekslahus oli erksinine. · 5 10 minuti pärast, kui substraat oli termostaadis saavutanus temperatuuri , lisasin sellele 0,5 ml uuritavat invertaasi töölahust. · Lahuse loksutasin läbi. · Kohe peale reaktsioonisegu läbiloksutamist võtsin sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja
Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab objektiivselt iseloomustada lahuse neeldumisspektri järgi. Töö käik ja tulemuste analüüs Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist 1. Eelnevalt kaalutud 0,6 g tomati peenestasin uhmris pestud liivaga ühtlase massi saavutamiseni. 2. Lisasin veevaba Na2SO4 et materjalis sisalduvat vett siduda kuni pulbrilise massi saavutamiseni. 3. Valmistasin 25ml mõõtsilinder ja varustasin see sobiva suurusega klasslehtriga paberfiltriga. 4. Tegin ekstraktsiooni heptaaniga (d = 0,72 g/cm3), määrasin kindlaks ekstrakti kogumaht: 22,5 ml Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Mõõtsin karotenoidide neeldumisspektri lainepikkuste vahemikus 350-650 nm kasutades võrdluslahusena puhast lahustit (heptaani). Töötasin klassküvettiga. 1. max1: A=0,1526 ABS; = 505 nm lükopeen (E% 1cm) = 3150 2
· Sama operatsiooni kordasin 5-minutiliste intervallidega veel 2 korda, s.t ensüümireaktsiooni 10-ndal ja 15-ndal minutil. · Peale viimase proovi võtmist võtsin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist välja. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine · Proovidega katseklaasid jätsin täielikuks sademe formeerumiseks 10 15 minutiks seisma. · Sel ajal panin valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustasin need sobivate väikeste klaas- või plastlehtrite ning paberfiltritega. · Proovid, millesse oli sade põhja settinud, filtrisin kuivadesse katseklaasidesse. Igasse katseklaasi oli ohtralt sadet sisse formeerunud, seega filtrisin iga katseklaasi sisu 1 korra. Saadud filtraadid olid täiesti selged. · Spektrofotomeetril määrasin nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi
automaatpipetiga gradueeritud katseklaasi 0,2 ml invertaasi lahust ja seejärel täitsin katseklaasi kuni 10 ml-ni puhverlahusega. Sulgesin katseklaasi korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine Kõigepealt võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH-väärtusega 4,8. Katseklaasi varustasin korgiga ja asetasin 5-10 minutiks vesitermostaati 30+-1oC juurde soojenema. Seejärel võtsin kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Kolbidesse viisin reaktsioonisegust (=hüdrolüüsisegust) kindlatel aegadel võetud proovid, et neis määrata taandavate suhkrute sisaldust. Kui substraat oli termostaadis saavutanud temperatuuri 30oC, lisasin sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, lahuse loksutasin läbi ja katseklaasi asetasin
uhmri nuiaga kuni ühtlase massi saavutamiseni. · Seejärel lisatakse väikeste portsjonitena veevaba naatriumsulfaati, et taimses materjalis vett siduda. Jätkatakse massi hõõrumist. Soola lisamine tuleb lõpetada, kui on moodustunud kuiv pulbriline mass. · Järgneb karotenoidide ekstraktsioon proovist orgaanilise lahustiga, milleks antud töös oli petrooleeter. Ekstrakti kogumiseks võtsin 25-ml mõõtsilindri, mille varustasin lehtri ja kuiva filterpaberiga. Siis alustatakse ekstraktsiooni, lisades peenestatud massile väikeste koguste kaupa ekstrahenti. Teelusika abil kantakse sademe kohal olev ekstrakt filtrile. Seda tegevust korratakse, kuni sademe kohal olev ekstrakt muutub värvusetuks. Määratakse ekstrakti kogumaht, milleks tuli 10,5 ml. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350-650 nm, kasutades
· Lisasin väikese koguse pestud liiva. · Hõõrusin uhmri nuiaga kuni ühtlase massi saavutamiseni. · Lisasin sinnasamasse väikeste portsjonitena veevaba , et taimses materjalis sisalduvat vett siduda. · Jätkasin samal ajal massi hõõrumist. · Lõpetasin soola lisamise, kui moodustus kuiv, pulbriline mass. · Valisin sobiva suurusega kuiva anuma ekstrakti kogumiseks. Valisin selleks anumaks 25 ml mõõtesilindri. · Varustasin mõõtesilindri sobiva suurusega lehtriga ning asetasin sellele kuiva paberfiltri. · Alustasin karotenoidide ekstraktsiooni proovist sobiva orgaanilise lahustiga. Selleks lisasin uhmris olevale peenestatud massile väikese koguse ekstrahenti. Lisasin esimesel korral ~ 10 ml oktaani. Edaspidi lisasin väiksemate koguste kaupa (~ 5- 10 ml), kuid piisavalt, et sademe kohalt oleks võimalik teelusikaga ekstrakti eraldada. · Materjali segasin lusikaga.
abrasiivmaterjali. 4. Hõõrun uhmri nuiaga kuni ühtlase massi saavutamiseni. 5. Lisan väikeste portsjonitena veevaba Na2SO4, et taimses materjalis sisalduvat vett siduda, jätkates samal ajal massi hõõrumist. 6. Jätkan soola lisamist, kuni on moodustunud kuiv, pulbriline mass. KAROTENOIDIDE EKSTRAKTSIOON (=väljalahustamine): 7. Võtsin kuiva 25 ml mõõtsilindri ekstrakti kogumiseks. 8. Varustasin mõõtsilindri plastlehtriga ja asetasin sellele kuiva paberfiltri. 9. Lisan uhmrisse olevale peenestatud massile 10 ml ekstahenti. 10. Lasen sademel põhja settida ning selle kohal oleva ekstrakti kannan teelusika abil filtrile, sadet kaasa ei võta. 11. Kordan eksraktsiooni, kuni sademe kohal olev ekstrakt muutub värvusetuks. 12. Viin kõik ekstraktid kogun loomulikult mõõtsilindrisse 13. Määran kindlaks ekstrakti kogumahu: 25 ml
annaabi.ee 
