geenid, aitamaks tuvastada komponente teatud raku protsessidel, nagu raku jagunemisel. Lisaks on RNAi paljutõotav töövahend nii biotehnoloogias kui ka meditsiinis. Kasutatud kirjandus: http://et.wikipedia.org/wiki/RNA_interferents http://en.wikipedia.org/wiki/Craig_Mello http://en.wikipedia.org/wiki/Andrew_Fire http://www.nature.com/nrg/multimedia/rnai/animation/index.html http://web.stanford.edu/group/hopes/cgi-bin/wordpress/2012/04/gene-silencing/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/probe/doc/ApplSilencing.shtml
tänu millele generaalsed transkriptsioonifaktorid seonduvad tugevamini. 6. Histoonne kood. a. Histoonne kood on histooni kindlas kohas paiknev kindel amoinohape, mille atsüleerimisel või siis deatsüleerimisel tekitatakse eukromatiin (aktiivne/avatud) või heterokromatiin (inaktiivne/kondenseeritud). 7. Pärmi rakus toimub vaigistamine (silencing) telomeersetes DNA alades. Missugused biokeemilised protsessid on selle telomeerse vaigistamise taga? a. Histoonide modifitseerimine heterokromatiin on tugevalt pakitud. 8. Mis on nukleosoom? Kirjelda eksperimenti, mis võimaldaks teha kindlaks, et transkriptsiooniliselt aktiivne DNA on teisti pakitud, kui transkriptsioo-niliselt inaktiivne DNA. a. Nukleosoom DNA ja histooni kompleks, peamised kromatiini struktuurühikud. b
tulemust. (loeng 6 meetodid) Northern Blot - Testib, kas mRNA on taimes olemas ja et transkriptsioon toimib korrektselt mRNA eraldatakse, kantakse filterpaberile. Radioaktiivse sildiga DNA proov seob mRNA külge ja on nähtav. Western Blot - Testib valgu olemasolu Valgu proovid eraldatakse transgeensetest taimedest, denatureeritakse ja kantakse membraanile. Prooviks on antikehad, mis tunnevad ära eesmärk valgu. siRNA - RNA vaigistamine (RNA silencing) on mitme etapiline protsess, misläbi kaksikahelaline RNA (dsRNA) töödeldakse valgu Dicer poolt nii, et tekivad lühikesed RNA dupleksid. Need väikesed RNAd järgnevalt seonduvad valguperekonnaga Argonaute. Tulemuseks on geeni vaigistamine. siRNA ja miRNA loomisel Dicer või Dicerisarnased (DCL) valgud lõikavad pikad dsRNA (kaksikahelaline RNA) või tagasivolditud (linguvõi juuksenõela-kujuline) RNA väikesteks ~ 21 25 nt fragmentideks siRNA-d kaitsevad genoomi:
Histoonne kood tähistab kõiki histoonide N-terminuses toimunud modifikatsioone. Koodi lugevad valgud tunnevad neid spetsiifilisi modifikatsioone ära ja promoteerivad kromatiini kondensatsiooni või dekondensatsiooni (histooni N-terminuse modifikatsioon omab olulist rolli kromatiini struktuuris ning kromatiini struktuur mängib tähtsat osa geeni ekspressiooni regulatsioonis). 25. Pärmi rakus toimub vaigistamine (silencing) telomeersetes DNA alades. Missugused biokeemilised protsessid on selle telomeerse vaigistamise taga? Kõigepealt (vb ei ole kah kõigepealt) peavad vaigistamisele mittekuuluvad histoonid saama hüperatsetüleeritud, mis takistaks SIR3 ja SIR4 seondumist sinna. Mitu koopiat Rap1 seob iga telomeerialas paiknevale korduvjärjestusele, seejärel seondub sinna Sir2, 3 ja 4 koosnev kompleks. Moodustuv heterokromatiinne struktuur ulatub Rap1-siduvate saitidega külgneva DNA ~4kb alale
Aktiivsed geenid on tundlikumad DNAaas I-le esinevad nn ülitundlikud piirkonnad, mis arvatakse olevat ilma nukleosoomideta ja DNA lahti keerdunud ja kättesaadavam transkriptsioonile. Tundlikud piirkonnad vastavad seega geeni regulaatorpiirkondadele. Teatud Lys jääkide metüülumine H3-s tuntakse ära spetsiifiliste valkude poolt mis põhjustab eriti kompaktse DNA struktuuri tekke ja geenide vaigistamise (silencing) Kromosoomide ehitus. Kui rakk läheb interfaasist mitoosi, siis rakus olev kromatiin muutub nähtavaks valgusmikroskoobis kromosoomidena. Seega mitoosis peab kromatiini struktuur muutuma veel kompaktsemaks kui see esineb kondenseerunud interfaasses kromatiinis. Kromosoomide struktuuri kirjeldamiseks sobivad kõige rohkem mitoosi metafaasis asuvad kromosoomid (maksimalselt struktureerunud). Koosnevad kahest õdekromatiidist (kumbki
Alternatiivselt on leitud bromodomääni sisaldavad valgud, mis tihti on seotud eukromatiiniga ning seonduvad histoonide N- atsetüleeritud sabadele. TFIID suurim alaühik sisaldab kaht järjestikku asuvat bromodomääni, mis aitavad moodustada aktiivse koodiga kromatiinil kompleksi, samas kui sellesama alaühiku atsetülaasne aktiivsus hoiab kromatiini hüperatsetüleeritud vormis. 27. Pärmi rakus toimub vaigistamine (silencing) telomeersetes DNA alades. Missugused biokeemilised protsessid on selle telomeerse vaigistamise taga? Pärmi telomeeride vaigistamine (silencing). Mitu koopiat Rap1 seob iga telomeerialas paiknevale korduvjärjestusele (telomeerid on nukelosoomidevabad piirkonnad) (Ülal). See initseerib multivalkse kompleksi kokkupaneku (all), kus osalevad Rap1, Sir2, Sir3, Sir4, ja lähedusesasuvate histoonide H3 ja H4 hüpoatsetüleeritud N-terminused. * tähistab hüperatsetüleeritud
vahendatud geeni vaigistamine toimub nii tuumas (taimedes) kui tsütoplasmas. RNAi - RNA interferents, post-transkriptsiooniline geeni vaigistamine, mille käigus 2- ahelaline RNA suunab homoloogse mRNA lagundamist tsütoplasmas. Seda terminit kasutatakse Drosophila ja Ceanorabditis'e uurijate poolt. Kuna see lühend on RNA vahendatud geeni vaigistamise nähtuse tähistamiseks kasutatavatest kõige lühem, siis eelistan kasutada just RNAi'd. PTGS - post-transkriptsiooniline geeni vaigistamine (silencing). Kasutatakse taimede puhul. Kasutatakse ka lühendit PTGS/RNAi. quelling - sama tähendusega termin Neurospora puhul. (quelling Ingl. k. - lämmatama, maha suruma) dsRNA - kaheahelaline RNA (double stranded) on RNAi oluline vahendaja. RdRP - RNA sõltuv RNA polümeraas suunab RNA sünteesi RNA matriitsi alusel, mille tulemuseks on dsRNA. See ensüüm ei ole RNAi toimumiseks vajalik kui rakus on suur kogus dsRNA'd.
- struktuur ja tähtsus neid kolme elementi on vaja replikatsiooni ja segregatsiooni korrektseks toimumiseks. 18. Telomeeri replikatsiooni mehanism. Et telomeeride lühenemist ei toimuks, lisab telomeraas, mis on valk-RNA kompleks, iga kromosoomi otstesse telomeerseid järjestusi. Telomeraas-assotsieeritud RNA on matriitsiks, millelt kromosoomi otstesse lisatav DNA- järjestus kopeeritakse. 19. Eukarüoodi (pärm) rakus toimub DNA vaigistamine (silencing) telomeersetes alades. Missugused biokeemilised protsessid on telomeerse vaigistamise taga? Heterokromatiini formeerumine, milleks on vajalikud valgud RAP1 ja SIR, mis paiknevad telomeeride piirkonnas. RAP1 seondub DNA järjestusele, mida nimetatakse vaigistajaks, SIR aga deatsetüleerib histoonide H3 ja H4 N-terminused. 20. Kromosoomsed aberratsioonid: mutatsioonid on organismi pärilikkusekandja püsivad, edasikanduvad muutused, deletsioonid eemaldavad osa kromosoomist, inversioonid on
kompleks (ingl-k. RNA-induced scilencing complex), kuhu kuulub ka Argonaut. RISC kompleks represseerib translatsiooni või lagundab mRNA RNA interferents, mille kutsuvad esile siRNA-d (mRNA lagundamine või heterokromatiniseerumine).siRNA-d (ingl.k. small interfering RNAs) on väiksed (~ 23 nukleotiidipaari) kaheahelalised RNA-d, mis tekivad Dicer’i toimel. Tekib kas RISC kompleks või RITS (ingl.k. RNA-induced transcriptional silencing) kompleks. RITS metüleerib histoone, DNA-d ning transkriptsioon peatub (heterokomatiseerimine) Pikkade mittekodeerivate RNA-de ja piRNA-de osa geeniekspressiooni kontrollis. lncRNA-d (ingl.k. long noncoding RNA) kodeeritakse RNA polümeraas II poolt, neil on cap- struktuur, polü-A saba ja nad on sageli splaissitud Seovad kokku valke, is juhivad sama protsessi, kontrollivad geenide transkriptsiooni samal kromosoomil (cis) või teisel kromosoomil (trans)
Hinni on vastupidine. mRNA vaigitamine C. elegans rakkudes - 2-ahelaline RNA suunab RNA lagundamist - DICR I toodab väiksemad jupikesed sellest 2-ahelalisest RNA-st lagundatakse → üheahelalised RNA-d. Märklaud RNA-sse tehakse auk sisse, ei saa midagi edasi toimuda RNAi - dicer valk (Rnaas III ortoloog) seondub 2-ahelalise RNA-ga 41 - dicer lagundab RNA 20-24 bp tükkideks (siRNA) - siRNA suunatakse RISC kompleksi (RNA induced silencing complex) - RISC kompleks leiab siRNA järjestuse alusel märklaud mRNA (komplementaarsuse alusel leitakse üles) - mRNA lagundatakse või muudetakse translatsioonikõlbmatuks miRNA – eriti olulised arenguliselt (microRNA) - genoomis kodeeritakse väikesed RNA-d - moodustavad „juuksenõela“ struktuure – 2-ahekalised osad lõigatakse välja - funktsioneerivad geenide vaigistamisel sarnaselt siRNA-le piRNA – nagu miRNA, aga päritolult teistsugused, 1-ahelalised RNA-d
XYY-Isased, STERIILSED, KÕHNAD, PIKKA KASVU. XXX-Emased, normaalsed, vahel probleeme viljakusega Kui meil on kaks ühesugust kromosoomi (XX), siis üks neist on inaktiivne. See võetakse maha ainult gameetide küpsemisel. Barri kehake välistab geeni üleekspressiooni. Barri kehakese moodustamine reguleeritakse spetsiaalse lookuse poolt nn. X kromosoomi inaktivatsiooni tsenter (Xic). Teine geen, Xist, toodab RNA, mis katab X kromosoomi ja sellega takistab tema ekspressiooni (ingl.k silencing). Barri kehake on inaktiveeritud x-kromosoom. Selliste fenotüüpide määramine ei ole lihtne. Paljudel juhtudel määratakse see geeni ekspressioonis tekkinud valgu ja ... toimel. Meessugu määrav geen on Y kromosoomis: Geen (SRY)toodab testist-määravat faktorit (testis-determining factor) See määrab gonaadi arengu. Kõik ülejäänud arengu erinevused tulevad juba hormonaalsest mõjust ja gonaadide tegevusest SRY produkt on tegelikult transkr
kaugusele, ilma et see häiriks teiste geenide tööd. Nii see, et transkriptsiooni aktivatsioon 54 tüüpi promootorilt saab toimuda ainult transkriptsiooni aktivaatori juuresolekul kui ka see, et aktivaator toimib distantsi kaudu, võimaldab tuua paralleele RNA polümeraas II poolt läbiviidava transkriptsiooni aktivatsiooni mehhanismidega eukarüootses rakus. Transkriptsiooni vaigistamine (transcriptional silencing) bakterites Geeniregulatsiooni negatiivne kontroll võib toimuda kahel viisil: 1) Repressioon; 2) Vaigistamine Repressiooni puhul seondub repressorvalk spetsiifiliselt promootorregiooni kindlasse saiti, pärssides RNA polümeraasi funktsiooni lokaalselt. Vaigistamise puhul katavad valgud ühtlaselt teatava DNA regiooni ja takistavad sinna teiste valkude seondumist. Selle tulemusena ei ole DNA kättesaadav ei DNA-d modifitseerivatele ensüümidele ega ka ligipääsetav RNA polümeraasile
annaabi.ee 
