c) Mõlemad, nii DNA kui RNA sisaldavad suhkrujääki, kuid ainult DNA sisaldab pentoosi d) DNA sisaldab fosfaatrühmi, aga RNA ei sisalda e) RNA suhkrujääk sisaldab täiendavat hüdroksüülrühma, mida DNA pentoos ei sisalda 12. Milline on nn. kolmanda põlvkonna sekvenerimismeetodite põhiline erinevus esimese ja teise põlvkonna meetoditest: a) Sekveneeritavat DNA-d ei amplifitseerita vaid järjestatakse otse reaal-ajas b) DNA sekveneerimiseks tekitatakse ensümaatiliselt erineva pikkusega fluorestsentsmärgisega fragmentide jadad, mis lahutatakse elektroforeesil c) DNA sekveneerimine toimub kloonide kaupa d) Kogu sekveneeritav DNA purustatakse, saadud fragmentidele liidetakse praimerid ning amplifitseeritakse sild- amplifikatsioonil kiibi pinnal 13. Restriktaas HindIII lõikab DNA-d järgmisest äratundmiskohast 5'AAGCTT3'. HindIII on seega:
Kas kasutatud kit sobis antud praktikumi töö teostamiseks, millest seda järeldada? Aeg 15 minutit Vajatav varustus Tsentrifuug DNA suurus 50bp kuni 23kb Sobivad proovid DNA TAE/TBE puhvriga agaroosgeelist DNA puhtus Kõrge kvaliteedi, puhtusega DNA, mis on sobilik sekveneerimiseks, ligatsioonireaktsiooniks jne... Kui palju DNA saadakse 50bp-10kb puhul 70-90% Praktiline töö nr. 5: Rekombinantse plasmiidi ligeerimine Eesmärk: Meid huvitava aplifitseeritud DNA järjestuse sisestamine vahevektorisse ehk paljundusplasmiidi. Materjalid: 1,25 µl pSTBlue-1 vektor Lineaarne vahevektor, kus on origin, (16ng/µl) antibiootikumide resistentsusgeen, lacZ
- sega korralikult läbi - tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min - eemalda supernatant - pesemiseks lisa sademele ~200 l 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min DNA Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt eraldatud/puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis). Ei teinud, sest lahus oli piisavalt puhas. (10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust: 2-3 l DNA-d 2,5 l DNA-d + 10 l 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla) Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse ,,hambasse" ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. 9 1kb 1kb Kristine Arvidas Hannes Oksana Marker Marker
vahekihti - DNA sadestamiseks lisa vesikihile 1/20 osa (5 l) NaOAc ja 3 mahtu (300 l) 95% etanooli - sega korralikult läbi - tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min - eemalda supernatant - pesemiseks lisa sademele ~200 l 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min 7 Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt eraldatud/puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis). (10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust: 10 l DNA-d + 2,5 l 5 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla) Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse ,,hambasse" ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. Elektroforeesi tulemused: Lisaülesanded: 3.1) Võrdle antud protokolli DNA kokaraamatus tooduga (vt. lisa). Millised etapid on samad, millised erinevad? Sinu arvamused, ettepanekud, küsimused? Kokaraamatus lisatakse lahust III 150µl ,me lisasime lahust III 400µl.
BAP aktiivne 65°C juures for at least 1 h ja seda inaktiveeritakse phenol extraction. Alkaalne fosfataas ,,CIP": fosfataas, mis eemaldab 3´ ja 5´ fosfaatrühmad DNAst ja RNAst. Hüdrolüüsib NTPd ja dNTPd. Kasutatakse kloonimisel, et vältida korduvat ligeerimist (Aga seda raske väljalülitada, võib häirida ligeerimist). Võib kasutada ka dNTP lõhutamiseks PCR reaktsioonis, et valmistada DNA sekveneerimiseks või SNP analüüsiks. Rnaas H: Lõhustab heterodupleksis (RNA/DNA) olevat RNA. Tulemusena moodustub üheahelaline DNA. Nukleaas S1: Lõhustab üheahelalist DNA ja RNA, moodustades 5´fosforüülitud mono- ja oligonukleotiide. 5. Millised omadused peavad olema plasmiididl, et ta saaks toimida kui kloonimise vektor? Antibiootikume resistentsust kodeeriv geen (ampitsiliin või tetratsükliin Väike suurus
Readide pikkus sõltub sooritatud tsüklite arvust. 34. Mis on 16S sekveneerimine ja milleks seda kasutatakse? https://www.youtube.com/watch?v=3UHiveJ1jzM 35. Kirjeldage Oxford Nanopore sekveneerimise protseduuri. https://nanoporetech.com/how-it-works 36. Kirjeldage Ion Torrent sekveneerimise protseduuri. 5:25-29. on DNA sekveneerimise meetod, mis põhineb DNA polümerisatsiooni käigus vabanevate vesinikioonide tuvastamisel. See on meetod "sünteesi teel sekveneerimiseks", mille käigus komplementaarne ahel on konstrueeritud matriitsi ahela järjestuse alusel. 37. Kirjeldage Nanopore sekveneerimise protseduuri. 5:30-34. MinION ™ seade on väike instrument, mis ühenadatakse otse sülearvutisse või lauaarvutisse USB kaudu. See on iseseisev seade tarnimiseks reaalajas eksperimentaalseid andmeid. Ionivool juhitakse läbi nanopoori, tekitades pinge üle selle membraani. Selle voolu mõõtmine võimaldab kindlaks määrata, mis molekuliga on tegu. 38
segu. Seejärel liidetakse nende DNA lõikude otstesse adapteroligonukleotiidid ja puhastatakse. Nüüd järgneb DNA amplifitseerimine, mis Illumina platvormi puhul toimub tahkele kandjale seotult. Selleks kasutatakse nn. Flow-Cell-i, kus paiknevad adapteritega komplementaarsed oligonukleotiidid, millele liidetakse DNA fragmendid. Sildamplifikatsiooni tulemusena tekivad Flow-Cell põhja identse järjestustega DNA klastrid Sekveneerimiseks kasutatakse eemaldatava floresentsiga terminaatnukleotiide ja vastavat DNA polümeraasi. Ühe sekveneerimise tsükli kohta liidetakse üks komplementaarne nukleotiid, loetakse ära sellega seotud fluorestsentsmärge 8 ning siis eemaldatakse antud fluorofoor ja blokaatorgrupp. SOLID tehnoloogia põhineb sünkroonsetes ligeerimistsüklites. SOLID tehnoloogia kasutab DNA amplifitseerimises emulsioon- PCR meetodit. DNA fragmentide raamatukogu valmistatakse mikrokuulidel
DNA denatureeritakse üheahelaliseks ning liidetakse flow-celli põhjas olevatele oligonukleotiididele. Toimub sildamplifikatsiooni teke, mille tulemusel tekivad identsed DNA klastrid. Peale amplifikatsiooni DNA fragmendid denatureeritaske ja komplementaarsed ahelad pestakse, nii et järgi jäävad vaid ühest otsast kinnitatud DNA üksikahelad. Neile lisatakse sekveneerimispraimerid mis on komplementaarsed DNA otsas olevate oligonukleotiididega. Nüüd on DNA valmis sekveneerimiseks. 18. Mille jaoks kasutatakse järgmise põlvkonna (Sangeri meetod on siin esimene põlvkond) sekveneerimist? Too näide mõnest projektist. Uue põlvkonna sekveneerimistehnoloogiaid on kasutatud erinevates genoomika uurimisvaldkondades, nagu nt kogu genoomi ja transkriptoomi sekveneerimine, transkriptsioonifaktorite seondumissaitide avastamine, mittekodeeriva RNA ekspressiooniprofiili määramine ja suunatud sekveneerimine. Näiteks Human Genome Project (HGP). 19
Muudab evolutsioonitempot. Selle tõttu bakterite fülogenees ei ole puutaoline ning seda ei saa esitada monofüleetiliste taksonite järgi. Metagenoomid: Evolutsioonilisest lähtepunktist ei saa vaadelda vaid ühe liigi DNA-d vaid terve bakterikoosluse genoome teatavas nisis. Seda lähenemist iseloomustab mõiste metagenoom, Kuna enamikke mikroorganisme laboris kasvatada ei saa, puudub informatsioon valdava osa mikroobide kohta. Sellest ka vajadus massiliseks sekveneerimiseks, Võimalik rekonstrueerida erinevate organismide täielike genoome, Lähtub pigem mitte genoomide võrdlustest bioomides vaid geenidest, mis on bioomides evolutsioonis fikseerunud, Suurim metagenoomide projekt Global Ocean Sampling Expedition on tuvastanud 6,12 mln. erinevat valku kodeerivat geeni! Metagenoomide geenikeskne analüüs: Võrreldes eri bioomide baktereid võib kindlaks teha spetsialiseerunud geeniperekonnad kindlas elupaigas eksisteerimiseks ning "kodukorra" geenid. 26
järjestus). Seisuga jaanuar 2004 (http://www.tigr.org) oli sekveneeritud 133 bakteri, 17 arhe ja 21 eukarüoodi genoom ning sekveneerimisel olevaid genoome on sadu. Seisuga aprill 2009 (vt. www.genomesonline.org) oli sekveneeritud 818 bakteri genoom, 104 eukarüoodi genoom ja 56 arhe genoom. 2497 bakteri genoomi ja 1029 eukarüoodi genoomi on sekveneerimisel. Genoomide sekveneerimine Inimese genoomi sekveneerimiseks käivitati teadusprojekt, kuhu kaasati laborid erinevatest riikidest. Töö koordineerimiseks loodi rahvusvaheline Inimese Genoomi Organisatsioon HUGO (Human Genome Organization). Esimeseks projekti juhiks oli James Watson, kes koos Francis Crick'iga oli kirjeldanud DNA kaksikhelikaalse struktuuri. 1993-ndast aastast juhib projekti Francis Collins. Töö jaotati erinevate teaduslaborite vahel (põhilised tegijad 8 laborit USA-st ja Sangeri Keskus Inglismaalt). 1998. aastal moodustas J
võimalik paljundada kas siis bakteri või eukarüoodi rakus. Tänu täiustunud tehnoloogiale, mis võimaldab üha kiiremini ja odavamalt määrata DNA nukleotiidset järjestust, on paeguseks sekveneeritud paljude organismide genoomi primaarjärjestus (nukleotiidne järjestus). Seisuga jaanuar 2004 (http://www.tigr.org) oli sekveneeritud 133 bakteri, 17 arhe ja 21 eukarüoodi genoom ning sekveneerimisel olevaid genoome on sadu. Genoomide sekveneerimine Inimese genoomi sekveneerimiseks käivitati teadusprojekt, kuhu kaasati laborid erinevatest riikidest. Töö koordineerimiseks loodi rahvusvaheline Inimese Genoomi Organisatsioon HUGO (Human Genome Organization). Esimeseks projekti juhiks oli James Watson, kes koos Francis Crick'iga oli kirjeldanud DNA kaksikhelikaalse struktuuri. 1993-ndast aastast juhib projekti Francis Collins. Töö jaotati erinevate teaduslaborite vahel (põhilised tegijad 8 laborit USA-st ja Sangeri Keskus Inglismaalt). 1998. aastal moodustas J
annaabi.ee 
