4. Transformeerimine a) Kompetentseteks nimetatakse rakke, mis on võimelised sisse võtma DNA-d. Kompetentsus võib olla kas loomulik või kunstlik, saavutatud laboritingimustes. Kompetentsus on vajalik selleks, et transformeerimisel soovitav plasmiid rakkudesse viia. Kompetentsete rakkude saamiseks laboritingimustes töödeldakse rakke kas KCl, CaCl või RbCl-ga, mis muudab rakumembraani DNAd läbilaskvaks. b) Rakkude kompetentsuse hindamiseks tranformeeritakse 100 l rakususpensiooni 10 pg, 100 pg ja 1 ng plasmiidiga (sobib lihtsalt tühi vektor, peaasi et kontsentratsioon on täpne). Kolooniate arvu järgi saav välja arvutada, mitu kolooniat tekib 1µg plasmiidi kohta. Kui 1 ng-ga transformeeritud tass annab 100 kolooniat, siis 1µg annab 100 000 (mis on suhteliselt viletsad). Head kompetendid on näiteks 10 8, see tähendab, et 1ng- ga transformeeritud tass annab 100 000 kolooniat, mida on ilmselgelt ülelugemiseks
mõned üksikud. 17. Lb. Lactis T6 grupeerunud tüved, kepikeste ahelad, tihe võrgustik. 18. L. Mesentereoides subsp. Mesenteroides T13 gram- positiivne, väga tihe tüvede võrgustik. Kepikesed. 19. L. Pseudomesenteroides T14 kepikeste võrgustik, paiknevad suhteliselt hõredalt. 20. Lb. Plantarum T15 Gram-positiivne. Tüved kepikestena. 1 Bakterite genotüüpide uurimine rep-PCR meetodiga Uuritavad tüved on vedelsöötmes ette kasvatatud. 1 ml rakususpensiooni pipeteeritakse 1,5 ml Eppendorfidesse ja seejärel tsentrifuugitakse 10 minutit. Seejärel supernatant eemaldatakse ja biomass suspendeeritakse 500 l puhvris. Loksutatakse ja segatakse Vortexil. Iga kultuuri puhul kasutatakse uut pipetiotsikut. Rep-PCR viiakse läbi eelnevalt valmistatud Mastermixi segu kasutades. Mastermixi segu jaotatakse PCR katsutitesse. Igasse katsutisse lisatakse 1 l kultuurisuspensiooni ja kontrollproovi pipeteeritakse 1 l MilliQ vett. Proovid
Termophilus- tihe kogumite võrgustik Lb. Plantarum-kepikestest moodutunud kogumid, mõned neist paiknevad üksikult Lb. Lactis- moodustunud üksikud väiksemad kogumid, ümarad 3. Bakterite genotüüpide uurimine rep-PCR meetodiga Uuritavad tüved on vedelsöötmes ette kasvatatud. 1 ml rakususpensiooni pipeteeritakse 1,5 ml Eppendorfidesse ja seejärel tsentrifuugitakse 10 minutit. Seejärel supernatant eemaldatakse ja biomass suspendeeritakse 500 l puhvris. Loksutatakse ja segatakse Vortexil. Iga kultuuri puhul kasutatakse uut pipetiotsikut. Rep-PCR viiakse läbi eelnevalt valmistatud Mastermixi segu kasutades. Mastermixi segu jaotatakse PCR katsutitesse. Igasse katsutisse lisatakse 1 l kultuurisuspensiooni ja kontrollproovi pipeteeritakse 1 l MilliQ vett. Proovid
Trüpsiin on proteaas, mis lõikab katki rakuadhesiooni valgud ning aitab rakud plastiku küljest lahti saada. Kui liiga kaua inkubeerida hakkab ka raku teisi valke lõikama. Et pärast inhibeerida trüpsiini toimimist, lisatakse 1 ml söödet (DMEM + 10% FBS + PEST). Suspendeerida rakud automaatpipetiga tassi küljest lahti. 3. Tassile peab jääma rakkude tihedus 10%. Meie hinnatud rakkude tihedus on 20%. Seega tassile peab jääma 600 μl rakususpensiooni. Ülearustest rakkudest (600 μl) teeme edasi lüsaati ning selleks võtame neid pipetiga uue epsi. 4. Lisada 4 ml-ni söödet (seega 3,4 ml), teha 8-kujulisi liigutusi ning asetada tass CO2 inkubaatorisse. 94. 95.Rakkudest lüsaadi valmistamine 96. Eesmärgiks on tutvustada erinevaid võimalusi rakkude lüüsimiseks valkude, RNA või DNA edasiseks analüüsiks. 97. Genoomse DNA eraldamine imetajarakkudest 98
Imesin vaakumiga PBS Lisasin 0,2 ml trüpsiin-EDTA 5 min-ks. Trüpsiin on proteaas, mis lõikab katki rakuadhesiooni valgud selleks, et rakud plastiku küljest lahti saada. Lisalin 1 ml söödet (DMEM + 10% FBS + PEST) selleks, et inhibeerida proteaasi. Suspendeerisin rakud automaatpipetiga tassi küljest lahti. Tassile peab jääma rakkude tihedus 10%. Meie hinnatud rakkude tihedus on 20%, seega tassile peab jääma 600 μl rakususpensiooni. Ülearustest rakkudest (600 μl) tehakse lüsaati, seega tõstsin rakud pipetiga uue epsi. Lisasin 3,4 ml söödet, tegin 8-kujulisi liigutusi ning panin tass CO2 inkubaatorisse. 3. Praktikum - rakkudest lüsaadi valmistamine (2014): Genoomse DNA eraldamine imetajarakkudest Rakud lüüsitakse puhvris, mis sisaldab SDS-i (lahustab rakumembraanid), NaCl, EDTA-d (inhibeerib nukleaase) ja proteinaas K-d (lagundab valgud) pidevalt segades 37°C või 55°C juures
ning eoskandjaid, püüdes viimaseid mitte vigastada. Suspensioon kaetakse õhumulle vältides katteklaasiga. Vedelsöötmetest pärinevate preparaatide uurimisel pole vaja lahjendusvett lisada. Biomassi sisaldav vedelikutilk kaetakse ettevaatlikult, õhumulle vältides, katteklaasiga. NB! Preparaate tuleb mikroskopeerida võimalikult kohe, kuna vedelik kuivab kiiresti. Ripptilk Kasutatakse spetsiaalseid süvendiga esemeklaase. Katteklaasile kantakse tilgake rakususpensiooni. Esemeklaasi süvend kaetakse katteklaasiga, püüdes uuritavat vedelikutilka mitte vigastada - tilk peab jääma süvendi sees katteklaasi külge rippuma. Preparaadid surmatud mikroorganismidest Rakkude kuju, asetuse, ehituse jm parameetrite kindlakstegemiseks uuritakse põhiliselt surnud mikroorganisme. Äigepreparaadi valmistamine Hästipuhastatud, rasvavabale esemeklaasile tehakse 1 - 5 preparaati. Põletileegis kuumutatud
punane värv. 12. Missugune probleem võib tekkida LIVE/DEAD komplektiga elus- ja surnud rakkude eristamisel? Värvus pole täpselt tuvastatav. Roheline võib tungida ka surnud rakkudesse. 13. Kas loenduskambrit kasutades on võimalik määrata mikroobide üldist arvukust joogivees? Selgita. Ei, loendusproovi maht on väike, loendamist segab bakterite liikuvus ja agregeeritus. 14. Millised on põhilised biomassi määramise meetodid? Otsene – kaalumine. Kaudne – rakususpensiooni hägu OD ja rakukomponentide hulga järgi. 15. Millist biomassi määramise meetodit kasutad, kui tegemist on helbelise konsistentsiga mikroobi suspensiooniga? Otsest – kaalumine. 16. Millel põhineb biomassi spektrofotomeetriline määramine? Suspensioonis olevad rakud neelavad valguse kogust, mis on propotsionaalne rakkude arvukusega suspensioonis. 17. Kas spektrofotomeetriliselt määratakse elus- või surnud rakke? Kõiki, põhineb rakukultuuri tihedusel. 18
toitainete [c] langus, hapniku [c] langus ja jääkide kogunemine kasvu piirama ja kasvukiirus langeb. Sellele faasile järgneb kasvu aeglustumise faas (retardation). Mikroobe aga on võimalik ka pikka aega hoida eksponentsiaalse kasvu faasis. Kemostaadid. Läbivoolusüsteem. Pidevalt lisatakse värsket söödet ja eemaldatakse osa rakke. Aeglustumisfaasile järgneb statsionaarne faas. Selles faasis võrdub surevate rakkude arvuga (populatsioonis rakkude arv jääb stabiilseks, rakususpensiooni optiline tihedus ei muutu, kuigi elusrakkude arv väheneb). Statsionaarses faasis püsivad rakud varuainete arvel. Statsionaarses faasis toimub sekundaarsete metaboliitide süntees (AB) ja sporuleeruvatel vormidel indutseeritakse endospooride moodustumine. Paljud mikroobid muutuvad statsionaarses faasis transformatsioonikompetentseks. Statsionaarses faasis suureneb ka mutatsioonide hulk populatsioonis. Osa neist osutub kasulikuks, võimaldades muteerunud mikroobidel näiteks
Üheks selle osaks on biotehnoloogia. Rakendusteadus - teadus, mis tegeleb mitmesuguste loodusteaduste abil saadud teadmiste praktilise rakendamise põhimõtete ja meetodite otsimise ja arendamisega, Rakis - organiteks liigendumata keha. Esineb näiteks vetikatel ja samblikel. Rakkude diferentseerumine - geenide valikulisest avaldumisest tulenev rakkude areng, mille käigus nad omandavad kindlale koetüübile iseloomuliku kuju ja talitluse. Rakkude kloonimine - hõreda rakususpensiooni külvamine pooltahkesse söötmesse või plastikplaadi lohkudesse või üksikute rakkude eraldamine mikropipetiga ja viimine paljundussöötmesse; samamoodi kloonitakse ka mikroobe. Rakukest - rakumembraanist väljapoole jääv taime-, seene- ja bakterirakule omane ümbris. Näiteks taimedel koosneb see põhiliselt tselluloosist, seentel kitiinist. Rakukloon - ühest eellasrakust mitootilisel jagunemisel tekkinud järglaskond, mis enamasti hõlmab paljusid rakupõlvkondi.
annaabi.ee 
