lühikesi kordusjärjestusi ehk STR lookusi, mille alleelid erinevad üksteisest pikkuse osas, seega ei ole vaja määrata DNA nukleotiidide järjestust, vaid kopeeritud DNA lõikude pikkusi Selleks kasutatakse elektroforeesi DNA analüüs Kuna aga multipleks-PCR-i kaudu paljundatud DNA fragmendid on siiski küllalt lähedase pikkusega, kasutatakse nende täiendavaks eristamiseks fluorestseeruvaid värve, mis on ühendatud reaktsiooni läbiviimiseks kasutatavate praimeritega Kõik algselt matriitsilt kopeeritud DNA-lõigud muutuvad värviliseks ning visualiseeritakse värviliste piikidena elektroferogrammidel DNA analüüs Viimane etapp seisneb tulemuste interpereteerimises ja proovidest saadud DNA profiilide võrdlemises Kui proovidest saadud DNA profiilid on erinevad, siis ei saa need proovid pärineda samast allikast, st samalt inimeselt Kui DNA profiilid on samad, siis võib tegemist olla samalt inimeselt pärinevate proovidega
- lõikavad DNA kindla koha pealt lõikudeks, nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad" 28. Milliseid ettevaatusabinõusid kasutab molekulaarbioloogia labor, et vältida valepositiivseid tulemusi?- töö etapid on ruumiliselt eraldatuderinevad tööruumid paiknevad järjestikuliselt ja samal päeval tagurpidi ei liigutakorralik desinfektsioon ja DNA lagundamise vahendid kasutatakse posit. Ja negat. KontrolliPosit. Tulemus kontrollitakse üle teiste praimeritega 29. Mida nimetatakse DNA hübridiseerumiseks? Too näiteid, milliste meetodite puhul seda kasutatakse.- DNA aluste paardumine, on spetsiifiline A-T; G-C / FISH; EISH 30. Kas DNA aluste paardumisel on oluline DNA päritolu? - EI 31. Nimeta kolm etappi, millest sõltub mikrobioloogilise diagnostika edukus ?- proovi võtmisest; transpordist; uurimustulemuse tõlgendamisest ja aseptikast 32
Oligonukleotiide sünteesitakse keemiliselt nii, et nenda otsad kattuksid omavahel. Nii need oligonukleotiidsed ahelad seovad omavahel ning kasutades DNA polümeraasi I ja Klenow fragmenti, dNTP olemasolul võib sünteesida kaksikahelat. Seda sünteetilist järjestus amplifitseeritakse PCR abil, lisades praimeri (forward ja reverse), Mg (katalüsaator), dNTP-d, Taq polümeraasi (teostab sünteesi kõrgel temperatuuril). PCR käigus toimub ahelate denatureerimine, praimeritega seondumine ja süntees. Seda tsüklit korratakse 30 korda. Seda etappi kontrollitakse kasutades elektroforeesi. Järgmisena toimub selle järjestuse ja vajaliku vektori töötlemine. Sõltuvalt sellest, mis otsad tahetakse saada (,,blunt" või ,,sticky") kasutatakse vastavalt vajalikud restriktaase. Lõigatakse sama restriktaasidega nii vektorit kui ka järjestust. Puhastatakse saadu produktid. Siis ligeeritakse vektorisse saadud järjestust (takistades ise-ligeerimist, kasutades nt.
DNA fragmentide ühendamine o DNA polümeraas I (RNA lõigatakse välja ja tühik sünteesitakse täis) o DNA ligaas (ühendab fragmendid ligeerimisel) o o Esineb DNA polümeraas III kaks katalüütilist tsentrit, kus replitseeritakse DNA liiderahel ning mahajääv ahel. o Praimosoom keerab lahti vanem-DNA kaksikheeliksi ja initsieerib sünteesi RNA praimeritega. o Replikatsioonil liigub vanem-DNA läbi replisoomi. o Replikatsioon toimub 5´ → 3´ suunas. Transkriptsioon o RNA nukleotiidne järjestus on määratud geeni ühe DNA ahela järjestusega o RNA transkript on DNA-lt maha loetud o Algne mRNA on pre-mRNA. o Pre-mRNA modifitseerimine o mRNA-s on informatsioon polüpeptiidi sünteesiks o Transkriptoom Geneetiline kood o Üldiseloomustus: Tripletne
T3 51 kraadi, T7 53 kraadi 4.2) Millise osa PCR produktist moodustab plasmiidi järjestus? Tee see kindlaks kasutades pBS KS+ plasmiidi kaarti (eelnevalt antud), nn. "multiple cloning site" järjestust kasutades. 160-170 nukleotiidi koos mõlemate praimerite ja vektoritega. 4.3) Arvuta Wallace reegli abil praimerite X: 5'-AAGATGCCATGAAGATGCCA-3' ja Y: 5'- TGGCATCTTCATGGCATCTT-3' sulamistemperatuurid. Milline näeb välja PCR profiil, kui nende praimeritega amplifitseerida 250 bp pikkust fragmeti. Arvesse tuleb võtta, et Taq polümeraasi kiirus on ligikaudu 1000 nt/min. Mõlema tulemus 58-5=53 kraadi.denaturatsioon 94 kraadi, ekstensioon 72 kraadi, hübridisatsioon 53 kraadi juures. ¼ minutist ehk lasta 15sek. 13 4.4) Kui 100 l PCR mastermix kohta panna 8 l 25 mM MgCl2, 10 l 2 mM dNTP ja 5 l mõlemat
madalam, siis sobiv temperatuur antud PCR reaktsiooniks on 56-5=51 oC. 4.2) Millise osa PCR produktist moodustab plasmiidi järjestus? Tee see kindlaks kasutades pBS KS+ plasmiidi kaarti (eelnevalt antud), nn. "multiple cloning site" järjestust kasutades. T7 promootorist SAC2 ni ja SAC2-st T3 promootorini. 4.3) Arvuta Wallace reegli abil praimerite X: 5'-AAGATGCCATGAAGATGCCA-3' ja Y: 5'- TGGCATCTTCATGGCATCTT-3' sulamistemperatuurid. Milline näeb välja PCR profiil, kui nende praimeritega amplifitseerida 250 bp pikkust fragmeti. Arvesse tuleb võtta, et Taq polümeraasi kiirus on ligikaudu 1000 nt/min. Praimerite X ja Y sulamistemperatuurid on : (9*4+2*11) =58 oC. 4.4) Kui 100 l PCR mastermix kohta panna 8 l 25 mM MgCl2, 10 l 2 mM dNTP ja 5 l mõlemat praimerit kontsentratsiooniga 100 ng/l, siis milline on MgCl2, dNTP ja praimerite lõplik kontsentratsioon? MgCl2 kontsentratsioon: (25/100)*8=2mM/µl dNTP kontsentratsioon: (2/100)*10=0,2 mM/µl
järgmise praktikumini. 2. päev: lisasin PCR segule 4 μl 6x DNA värvi, et DNA nähtav oleks, ning kandsin kogu segu TAE geelile (hambasse). DNA lahutamine toimub elektrivoolu toimel (100 V 15 min) 25. 26. 27. 28. 29. 30. Kuna minu produkt ei ole üldse geelipildil nähtav, võin järeldada, et midagi tegin valesti PCR reaktsiooni teostamisel (nt. viga pipeteerimisel või mingi muu viga). Sain geelitükki teiste plasmiidi ja praimeritega. 31. Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari. 32. 33.PCR produkti puhastamine geelist Zymoclean kitiga. 34. Eesmärgiks on puhastada välja PCRi segust meid huvitav produkt, et vältida praimerite, nukleotiidide või erinevate soolade mõju järgmisele etapile. 35. Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari. 36. Puhastamine: 1. Saadud geelitükk kaalus 0,04 g
ö. koodi osast L-DNAst, mille kaudu toimub tahkele kandjale sidumine. Vähendab olulist müra ja tõstab spetsiifilisust. Kromatiini immuunsadestamine kiipidel (ChIP-on-chip): Genoomne DNA inkubeeritakse valguga ning stabiliseeritakse cross-linkimise teel. Valk pretsipiteeritakse spetsiifilise AK-ga ning lagundatakse. DNA ahel märgistatakse ja hübridiseeritakse kiibile. Tundmatute eksonite identifitseerimine kiipidel: RNA või cDNA hübridiseeritakse kiibile seotud eksonispetsifiliste praimeritega. Amplifikatsioonisignaali tugevus kiibil näitab uute eksonite olemasolu. 9.Koekiibid Organiseeritud kudede parafiinlõigud (0,6mm).Koostatud sadadest prooviblokkidest . Kasutatavad metoodikad: 1.IHC 2.ISH 3.FISH 4.HC Koekiipide plussid ja miinused: -Uute antikehade sobivuse testimine -Uute prognostiliste antigeenide leidmine -Arengubioloogilised küsimused -Võimalus kiirpatoloogiliseks uuringuks -Võimalik edasiarendus rakukiip -Kudede omadused muutuvad sügavuti
annaabi.ee 
