tekivad vesiniksidemed. 4. lõigud ühinevad Ensüüm ligaasi abil komplementaarsuse alusel; ühendatakse eri päritolu DNA kleepuvate otste vahele tekivad lõigud omavahel kovalentsete sidemetega kokku tekib vesiniksidemed. 4. Ensüüm rekombinantne DNA molekul. ligaasi abil ühendatakse eri Plasmiidne päritolu DNA lõigud omavahel geenivektor(TAIM):1. kovalentsete sidemetega kokku Restriktaas lõikab DNA lahti tekib rekombinantne DNA kindla järjestuse kohalt. 2. sama restriktaasiga lõigatakse molekul. välja siiratavat geeni sisaldav Plasmiidne DNA osa. 3. plasmiid ja DNA geenivektor(TAIM):1.
Second level Third level Fourth level Fifth level 1. Välismembraan 2. membraanidevaheline ruum 3. sisemembraan 4. strooma 5. luumen (tülakoidi siseruum) 6. tülakoidi membraan 7. graan (tülakoidide virn) 8. tülakoid (lamell) 9. tärklis 10. ribosoom 11. plasmiidne DNA 12. lipiiditilgake Ehitus Enamus kloroplaste koosnevad kahest membraanist. Kloroplast on täidetud valgulise vesilahusega stroomaga , milles leidub DNA ja RNA rõngasmolekule ning ribosoome. Stroomas on lamedad membraansed kotikesed lamellid . Lamellides esined roheline värvaine klorofüll . Klorofülli molekulid koos teiste pigmentide ja valkudega moodustavad 2 fotosüsteemi. Kloroplastid
saamiseks. RNA splaising- RNA transkriptist eemaldatakse intronid ja liidetakse eksonid PÖÖRDTRANSKRIPTSIOON- geneetilise info ülekanne RNA-lt DNA-le. DNA süntees RNA järgi, tekib cDNA. DNA sekveneerimine- protsess, mille käigus selgitatakse DNA nukleotiidne järjestus 3. Geenivektor, selle loomise protsess, ligaas, restriktaas (ja tekkivad „kleepuvad otsad"), rekombinantne DNA. Õp lk 37 – 39. Plasmiid. Viirusvektor, plasmiidne geenivektor. - õp lk 38. Rekombinantne DNA- DNA molekul, milles ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid. RESTRIKTAAS- ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Enamik lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised (kleepuvad otsad). Kui need fragmendid lahuses kokku viia, siis paardumisel nad ühinevad.
Tsentrifuugin plasmiidse DNA 10 mini. Eemaldab supernatandi ja viskan selle ära. Pesen sadet etanoolidga. Suspendeerin 30 µl MQs. Mis juhtub erinevate biomolekulidega aluselises keskkonnas? Aluselise keskkonna loob E2 lahus. Selle tagajärjes bakteriraku membraani fosfolipiidid moodustavad mitsellid ja valgud denatureeruvad. NaOH denatureerib DNA kõrgemat järku struktuurid. Kuidas tagada, et välja puhastuks vaid meid huvitav plasmiidne DNA, mitte bakteri enda genoomne DNA. Peale E2 lahuse lisamist ei tohi liiga kaua inkubeerida. Muidu denatureerub ka plasmiidne DNA mis järgmises etapis sadeneb. Laboris puhastati plasmiidset DNA’d, aga saadud plasmiidi kogus tuli liiga väike. Mida korduskatses teisiti teha? E1 lahuse lisamise järel tuleb veenduda et lahusesse ei jääks tükke. Kõik peab olema piimjas mass. Muidu need tükid ei lüüsu täielikult. Jälgida, et peale E2 12
Geenitehnoloogia eeliseid ja puudusi (nn tavatehnoloogiaga võrreldes). Mutagenees- protsess, mille käigus toimuvad muutused organismi DNA järjestuses (mutatsioonid), mis jäävad genotüüpi püsima Transgenees- protseduur transgeensete organismide saamiseks (loomadel nokaut) +- suurem saagikus, uued ravimid, keskkonna saastuse vähenemine - - väheneb looduslik mitmekesisus, maitseomaduste halvenemine 7. Rekombinantse DNA loomine, geenivektor (plasmiidne geenivektor, viirusvektor). Restriktaas, ligaas, „kleepuvad otsad“. Osata koostada skeemi. Restriktaasid on ensüümid, need lõikavad DNA kindla koha pealt lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA juppe on mugavalt liita. DNA ühendamiseks piki suunas kasutatakse ensüüme nimega ligaas. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Geenid viiakse õigesse kohta kohale bakteri plasmiidiga
antibioootikumid penitsilliini siduva proteiiniga nii G- kui G+ mikroobidel anaeroobe. minimaalne aktiivsus stafülokokkide (bakteritsiidsed) (PBP) (plasmiidne DNA, G- suhtes • Peptidoglükaani süntees kromosomaalne): β-laktamaas- kõik streptokokid, meningokokid, enamik G+ pärssub, rakuseinaga seotud o S
Intronid, eksonid, RNA splaising, pöördtranskriptsioon ja pöördtranskriptaas (õp lk 37, 40), genoomipank (lk 39). DNA sekveneerimine – mõiste. Vt esitlust Transkriptsioon (geeni struktuur) ja õpikust lk 40 ning üldist, kogu materjali esitlust (Rakendusbioloogia, lõpuosa slaidid) + vihikist tunni materjalid. 3. Geenivektor, selle loomise protsess, ligaas, restriktaas (ja tekkivad „kleepuvad otsad"), rekombinantne DNA. Õp lk 37 – 39. Plasmiid. Viirusvektor, plasmiidne geenivektor. - õp lk 38. 4. Geneetikas enimuuritud liigid (eri organismirühmadest), nende valiku kriteeriumid. (vt esitlus Geeniotehnol_enimuuritud). - Kasvaja jälgimine, bioluminestsents, inimese DNA viimine sea munarakku, mikroinjetsioon, bioplaste lagundavad bakterid, valgesilmsele äädikakärbsele punasilmsuse geen. GM taimed: kahjuritele vastuvõtmatud kultuurtaimed nt.
Lammas Dolly oli esimene edukas tuumkloonitud imetaja. Mida nimetatakse geenivektoriks ja kuidas seda tehakse ? Geenivektor on siiratav geen ühendatud sellisesse DNA- või RNA-kompleksi, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Plasmiidi ja DNAd töödeldakse sama restriktaasiga, et lõigata need katki samasuguse nukleotiidjärjestuse kohalt. Saadud DNA lõik liidetakse plasmiidiga ligaasi abil ning rekombinantne plasmiidne geenivektor on loodud. Mille poolest erineb embrüonaalkloonimine tuumkloonimisest ja mis tekitas tugeva eetilise vastuseisu tuumkloonimisele ? Embrüonaalkloonimine seisneb embrüote lõhestamises. See on loomuliku protsessi tehnoloogiline teisend ning kõik lõigustusrakud on võimelised arenema normaalseks tervikorganismiks. Tuumkloonimine seisneb somaatilise keharaku tuuma viimises munarakku, mille oma tuum on eemaldatud. Selle efektiivsus on väga väike ning suur hulk embrüosid surevad
isotooniliseks, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10nM EDTA-Na2 – seob katioone, inhibeerides ensüüme(DNAaasid) ja destabiliseerib raku membraani, RnaasA 10 µl/ml – eemaldab bakteriaale RNA prepsist). Lisasin 0,2 ml E2 lahus(0,2 N NaOH, 1% SDS – detergent, lõhustab bakteriraku membraani, denatureerib valku ja laseb aluse DNAd degradeerima. Kuna plasmiidne DNA on tsirkulaarne, siis ahelad ei eralduvad), suspendeerisin. Inkubeerin laua peal 5 minutit. Lisasin peale 0,2 ml E3 lahus(5 M KOAc – peatab lüüsi, mille tagajärjel valgud ja genoomne DNA sadenevad välja. Reageerib SDS-da, tekitades ka mittelahustava sadet. 10% äädikhape pH normaliseerimine. Plasmiid DNA renatureerub ja asub nüüd supernatandis, ulejäänud – sade
tülakoidi membraan; 7. tülakoidide virn; 8. tülakoid (lamell); 9.tärklisetera; 10. ribosoom; 11. plasmiidne DNA; 12.lipiiditilgad 2 Fotosünteesi üldreaktsioon Fotosüntees on kõige tähtsam biokeemilise aineringe lüli. Kõik ülejäänud organismid sõltuvad selle käigus toodetud orgaanilisest ainest. 6CO2 + 12H2O +footonid C6H12O6 + 6H2O + 6O2 I. Fotosünteesi valgus-staadium Reaktsioonid kulgevad kloroplastide tülakoidides valgusenergia mõjul.
rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada mikro organismi DNA või RNAga. Selliseid DNA konstrukte nimetatakse geeni vektoriteks ehk siirdajateks. Vaatleme plasmiidse geenivektori saamist. Plasmiid on baketeris. See on DNA väike rõngas. 1) Restriktaas lõikab selles DNA lahti. 2) Sama restriktaasiga lõigatakse lõik inimese genoomist. Need ühinevad komplentaalselt. 3) Plasmiid ja DNA konstrukt segatakse kokku, kleepuvad otsad ühinevad. Nii saadakse lõppkokkuvõttes plasmiidne geenivektor, mis omakorda sisestatakse bakterorganismi. Tänu sellele tehnikale on võimalik luua DNA panku. Need osutuvad vajalikuks teaduslikel eesmärkidel. Nendest bakteritsest saab alati eraldada DNA lõike. Tänapäeval on teada, et terve DNA sisaldab kodeeritavaid lõike ehk eksoneid ja mitte kodeeritavaid lõike ehk introneid. Eksonid on vajalikud selleks, et sünteesida mRNAd, mis omakorda peaks määrama ära valgud. On võimalik saada aga sellist
7. Pipeteeri peale 0,3 ml E3 lahust ja raputa segu kuni see on täiest ühtlane. Peaksid nägema helbeid, mitte valkjaid triipe lahuses. 8. Tsentrifuugi 10 min maksimumpööretel toatemperatuuril (RT) eppendorfi põhja tekkis purune sade, vähesel määral oli valgeid helbeid ka lahuse pinnal. 9. Tõsta supernatant uude epsi ning lisa sinna 0,5 ml (0,7 mahtu) isopropanooli ja sega hoolikalt. 10. Tsentrifuugi plasmiidne DNA põhja 10 minutit maksimumpööretel (RT) Pane epsi ,,sabad" tsentrifuugis suunaga väljapoole, see on oluline selleks, et teaksid kuhu pisike DNA sade tekib. DNA sade oli mööda eppendorfi seina umbes 0,75 ml kriipsuni 11. Eemalda ettevaatlikult supernatant. 12. Pese sadet sooladest vabanemiseks 70% etanooliga. See tähendab: pipeteeri sademele 200l 70% EtOH, tsentrifuugi 5 minutit maksimumpööretel RT ning
hulgaga palju seda plasmiidi (paljundame seda bakteris). Bakterid on eelnevalt töödeldud divalentsete katioonidega (Ca2+, Mn2+), mis muudab rakuseina laengu positiivseks. Plasmiidse DNA lisamisel kinnitub see rakuseinale. Bakteri rakke kuumutatakse lühikest aega ning kuna E. Coli rakke töödeldakse külmades tingimustes, toimub temperatuuri muutus (heat shock) ning selle tulemusena tekivad rakuseina kahjustused, kust plasmiidne DNA pääseb rakku. 51. Sini-valge selektsioon: järjestus on kodeeritud lacZ keskele ning lacZ kodeerib β- galaktosidaasi. Substraadi X-gal juuresolekul tekitavad bakterid elutegevuse käigus (β- galaktosidaas hüdrolüüsib glükosiidsideme ja tekivad galaktoos, mille bakter ära sööb, ning 5- bromo-4-kloro-3-hüdroksüindool, mis dimeriseerumise ja oksüdeerimise tagajärjel annab sinist värvi) sinist pigmenti – kolooniad on sinised
annaabi.ee 
