töötavad komplementaarse ahela sünteesil matriitsina. Rakuline vigade korrigeerimine (proofreading aktiivsus) ning teised veaparandusmehhanismid kindlustavad replikatsiooni võimalikult suure täpsuse. [1] DNA replikatsioon toimub kõikides rakkudes semikonservatiivse mehhanismi alusel: iga uus DNA kaksikahel koosneb ühest originaalahelast ja ühest uuest ahelast.[2] Raku DNA replikatsioon algab spetsiifilistelt genoomi lõikudelt, mida kutsutakse originideks. DNA ahelate lahtikeerdumine origini kohalt ning uute ahelate süntees tekitavad aktiivse struktuuri, mida nimetatakse replikatsioonikahvliks. DNA polümeraas on ensüüm, mis sünteesib uut DNAd, lisades sünteesitavale ahelale nukleotiide, mis vastavad (komplementaarsuse alusel) algahelale. Lisaks DNA polümeraasile on replikatsioonikahvliga seotud veel palju teisi valke, mis aitavad kaasa DNA sünteesi alustamisele ning kulgemisele. DNA replikatsiooni saab läbi viia ka in vitro (kunstlikult, rakuväliselt)
expression factor). Polühedriini promooteris asub samuti TAAG järjestus ning promooteri aktiivsust reguleerivad järjestused, mis paiknevad 50 bp fragmendis allpool TAAG elementi ja on vajalikud promooteri hüperaktiivsuse saavutamiseks (see regioon on VLF-1 trans-aktivaatori seondumiskoht). DNA replikatsioon ja virionide moodustamine Replikatsiooniks on vajalikud vähemalt kuus viiruse valku (IE1 – toimib kui origini äratundev valk, DNA pol, p143 (helikaas), lef-1(praimaas), lef-2 (praimaasiga seotud valk), lef-3 (ssDNAd seondav valk)) Bakuloviiruse DNA replikatsioon toimub rakutuumas veereva ratta mehhanismi abil. Kui on sünteesitud uued DNA-d ja viiruse struktuursed valgud, siis algab virionide moodustumine. Nukleokapsiidid moodustuvad hilise ja väga hilise geeni-ekspressiooni faasi jooksul.Kapsiidide moodustumine leiab aset virogeense strooma (struktuur, mis moodustub nakatatud rakkude
vaja tüüp II restriktsiooni endonukleaase. Restriktaasid tunnevad ära kindlaid palindroomseid (järjestus on mõlema ahela 5’-3 suunas sama) DNA järjestusi ja on võimelised neid kindlas piirkonnas kindlas suuruses (tüüpiliselt 4-8 kb pikk) lõikama, tekitades ülekattuvate otstega fragmente, mis on samaaegselt identsed ja kompelmentaarsed, et saaks komplementaarselt paarduda. Lõigatud DNA fragmente saab sisestada sarnaselt lõigatud vektorisse, mis kannab replikatsioon origini, et rakus iseseisvalt replitseeruda. Saadakse hübriid-DNA molekulid ehk rekombinantsed DNA molekulid, mis transformeeritakse sobivasse peremeesrakku. Iga peremeesrakk võtab ühe rekombinantse DNA molekuli sisse. Transformeeritud rakud pannakse kasvama ning rekombinandid paljunevad peremehest eraldiseisvalt. Paljunemisega tekivad kloonid ehk identsed rakud. Väljaplaatimisega saab kloonid eraldada ning uuesti kasvamapanemisega saab kloone juurde paljundada.
Kontrollgeelilt on näha üks õige pikkusega (um 300 bp) lõik, mis näitab, et puhastamine on õnnestunud. Geeli analüüsil selgus, et inserdi kontsentratsioon oli umbes 13,7 ng/l. Kuna vektori ja inserdi pikkuste suhe 3851/330=11,7. Kuna vektorit oli 9 ng, saame leida vektori ja inserdi koguste suhte: (13,7*11,7)/9=17,70. See suhe on küllaltki sobiv. 3. Rekombinantse plasmiidi ligeerimine a) Kasutasime pSTBlue-1 vektorit, mis sisaldab kahte replikatsiooniks vajalikku origini (üks kummaski suunas), ampitsilliini ja kanamütsiini resistentsusgeeni ja lacZ operoni, mille lugemisraami sisestame oma inserdi. See võimaldab sini-valge meetodil välja selgitada, millistes kolooniates on tühi, millistes meie inserti sisaldav plasmiid. Vektoril on T-overhangidega otsad, mis võimaldab A-overhangidega inserti sisestada. b) PCR-i produkti on võimalik vektorisse ligeerida, kuna vektoril on T-overhang otsad
(transport) rRna- ribosoomi katalüütiline komponent. Moodustab koos valkuteda tsütoplasmas nukleoprotiini e ribosoomi. Ühendab aminohapped omavahel valkudeks. Mittekodeeriv RNA(ribosoomi) 7. Mis on replikatsioon, kuidas see toimub? DNA kahekordistumine, selle tulemusena saadakse ühest DNA molekulist kaks ühesuguse nukleotiidse järjestusega DNA molekuli. Raku DNA replikatsioon algab spetsiifilistelt genoomi lõikudelt, mida kutsutakse originideks. DNA ahelate lahtikeerdumine origini kohalt ning uute ahelate süntees tekitavad aktiivse struktuuri, mida nimetatakse replikatsioonikahvliks. DNA polümeraas on ensüüm, mis sünteesib uut DNAd, lisades sünteesitavale ahelale nukleotiide, mis vastavad (komplementaarsuse alusel) algahelale. Lisaks DNA polümeraasile on replikatsioonikahvliga seotud veel palju teisi valke, mis aitavad kaasa DNA sünteesi alustamisele ning kulgemisele. 8. Mis on geen? Geen on DNA järjestuse lõik, funktsionaalne ühik, mis kodeerib valku või
kontsentratsioonides, iga molekuli vektori jaoks peaks olema segus kolm sisestava DNA molekuli. DNAde otsad seovad komplementaarselt kokku ligaasi abil. 44. Me kasutasime kloneerimiseks pSTBlue-1 vektorit (T-overhangidega), kuhu saab sisestada saadud DNA järjestuse (A-overhangidega inserdi 3’ otsades). Toimub A-T otste komplementaarne paardumine ning vektor ja DNA ligeeritakse. 45. 46. pSTBlue-1 vektor sisaldab replikatsiooni vajaliku origini, antibiootikumiresistentsuse geeni ning ka lacZ operooni, mis annab bakterile lisatoitumisallika, kuna kodeerib β-galaktosidaasi. β-galaktosidaas lõhub β1-4 glükosiidsidet ja erinevaid substraate ette söötes saame kindlaks teha, millised meie kasutatud bakterikoloonuatest sisaldavad tühja plasmiidi ja millistel on insert seda ensüümi kodeeriva järjestuse „ära rikkunud“. 47
meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). Meie majas on kasutusel ka Amaxa Nucleofector –aparaat, mis kombineerib elektroporatsiooni ja keemilisi transfekteerimise meetodeid. Võimaldab efektiivsemalt transfekteerida rakke, mis muude meetoditega hästi ei taha transfekteeruda. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: • komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (origini- prokarüootset replikatsiooni alguspunkt, antibiootikumi resistentsusgeeni) • kloneerimisala (MCS) – sisaldab paljude erinevate restriktaaside lõikekohti • uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) • eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust(SV40) Sageli ka: • reportergeeni (GFP, lacZ jt.) järjestus • märgise järjestus(FLAG, myc, V5, GFP) • selektsioonimarkeri ekspressioonikasset
mõlemas suunas). Originid on tavaliselt A-T rikkad (sisaldavad palju adeniini-tümiini aluspaare) ja aitavad sellega lahtikeerdumisele kaasa, sest A-T aluspaaridel on kaks vesiniksidet (mitte kolm, nagu C-G paaridel). Seega on A-T sidemeid lihtsam lõhkuda, sest väiksema arvu vesiniksidemete lõhkumise jaoks kulub vähem energiat. Pärast DNA ahelate eraldamist luuakse algahelatele RNA praimerid. Juhtivale DNA ahelale sünteesitakse üks RNA praimer aktiivse origini kohta, mahajäävale ahelale sünteesitakse aga mitmeid praimereid, neid nimetatakse avastaja järgi Okazaki fragmentideks. DNA polümeraas pikendab juhtivat ahelat pidevalt, mahajäävat ahelat aga fragmentide kaupa. RNaas eemaldab replikatsiooni initsiatsiooniks kasutatud RNA praimerid, ning teist sorti DNA polümeraas liitub ahelatega, et täita sünteesimata fragmente. Pärast seda liitub DNAga ligaas, mis liidab augud ahelas ning lõpetab sellega replitseeritud DNA molekuli sünteesi. 8
Kromosoom on tihedaim keskelt ning hõredaim otstest. DNA kondenseeritus muutub ka rakutsükli jooksul, ühe jagunemise ajal võib toimuda mitu kromosoomi kondenseerumist ja dekondenseerumist. Arvatakse, et replikatsiooni initsieerimisel on E. coli'l kromosoomi origin ja ter-piirkond raku keskel, replikatsioo-ni käigus liiguvad originid bakteri terminustesse ning keskele jäävad ter järjestused, millele järgneb raku jagunemine. Osa baktereid reorganiseerib origini asukoha kahe replikatsiooni vahel, osa mitte. Näiteks E. coli origin liigub kahe replikatsiooni vahel raku keskossa, samas Caulobacter crescentus'el on origin alati ühe pooluse pool. Lisaks kromosoomsele DNA-le on bakteril veel DNA-sid, mis on keskkonnaga kohanemise seisukohalt olulised plasmiidid. Üldiselt peetakse plasmiide eluks mittehädavajalikeks. Plasmiidid aitavad koha-neda teatud keskkonnatingimustega ning üldiselt plasmiidid ei sisalda elutegevuseks hädavajalikke geene nagu
annaabi.ee 
