kokku kindla aja tagant võetud ühesuguse mahuga üksikproovid ning seejärel võetakse saadud segust analüüsimiseks vajalik kogus. Kõrgsurvevedelikkromatograafia töö põhimõte: Vedelikkromatograafia on väga efektiivne ja laialt kasutatav meetod keskkonnauuringuteks. See meetod sobib eriti hästi vedelike analüüsiks, sest vedeliku proovi ettevalmistamine ei eelda ekstraktsiooni ja vastavalt sellele ei teki aine kadusid. Vedelikkromatograafias puuduvad piirangud aine molekulmassile ja on võimalik lahutada ka kõrgmolekulaarsete ainete segusid. Kromatograaf: kõrgsurvevedelikkromatograaf CLAS MPm (Labio) Detektori tüüp: SAPHIRE UV/VIS detektor Kolonn: MAG 0 (1,6 mm sissediameeter x 150 mm pikkus) Kolonni täidis: Biospher PSI 100 C18, 5m Proovi maht: 20 l Proovi süstimiseks vajalikud parameetrid: Eluent: 30% atsetonitriili, 70% vett ja 0,1% äädikhape vesilahus Standardne voolukiirus: 70 l/min Lainepikkus: 280 nm Saasteainete identifitseerimine:
Reeglina PAH-ide keemilised ja füüsikalised omadused sõltuvad tugevasti molekulmassist: molekulmassi suurenedes vähenevad PAH-ide vees lahustuvus, aururõhk ning PAH-ide vastupanuvõime redutseerumise ja oksüdeerumise suhtes, kuid suurenevad sulamistemperatuur, keemistemperatuur ning suureneb PAH-i lahustuvus rasvades. Elusorganismidele mürgiseks loetakse PAH-e, mille molekulmass jääb vahemikku 128,16–300,36 g/mol, sest tänu oma madalale molekulmassile on nad keskkonnas liikuvamad kui suurema molekulmassiga PAH-id. Suurema molekulmassiga PAH-id (molekulmass suurem kui 300,36 g/mol) on vähem liikuvad keskkonnas, sest neil on suurem molekul ning väiksem lendumis- ja lahustumisvõime. Polütsüklilised aromaatsed süsivesinikud on lipofiilsed, see tähendab, et nad lahustuvad paremini orgaanilistes solventides kui vees. PAH-id hüdrolüüsil lagunevad kehvalt, kuid valguse toimel võivad oksüdeeruda ja ka laguneda (leiab aset
YASB 21 Õppejõud: Töö teostatud: Protokoll esitatud: Tiina Randla 27.02.2013 12.03.13 1. Töö teoreetilised alused 1.1 Töö eesmärk Eesmärgiks oli ette antud lahuses sisalduvate ainete lahutamine nende molekulmasside suuruse järgi. Seda saab läbi viia geelkromatograafia ehk geelfiltratsioonkromatograafiaga, mis on üks kromatograafia meetoditest. Tänu ainete erinevale molekulmassile liiguvad nad geelist läbi erineva kiirusega, kusjuures geeli poorsus peab olema selleks võimalikult ühesugune. Seda meetodit võib kasutada makromolekulide lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks. 1.2 Segu geelkromatograafilise lahutamise põhimõte Protsess viiakse läbi kolonnis, mis on kinnine süsteem ja ta on täietud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on umbes sama suured lahuses olevate
eluaati kogu selle protsessi vältel üksikute fraktsioonidena ongi võimalik segu komponendid üksteisest lahutada. 2.1.1 Geelkromatograafia Antud töös on ainete segu lahutamiseks kasutusel geelkromatograafia e. geelfiltratsioon- kromatograafia. Selle kromatograafia meetodi põhimõte: lahuses sisalduvate ainete lahutamine molekulmassi suuruse järgi (tuntud ka kui molekulaarsõelte meetod ja eksklusioonkromatograafia). Lahuses sisalduvad ained liiguvad tänu erinevale molekulmassile läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse: - makromolekulide lahutamiseks - lisandite eemaldamiseks - puhvri vahetamiseks - soolade eraldamiseks Uuritav proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil. See protsess viiakse läbi kolonnis, mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus uuritavas lahuses sisalduvate makromolekulide mõõtmetega.
Seletage põhjalikult vedelikukromatogaafi tööpõhimõtet. Mis aineid määratakse selle seadme abil? Mis põhikomponentidest koosneb see seade? Seletage mõni gaasikromatograafi komponendi tööprintsiipi. Gaasikromatograafia võimalused piirduvad molekulidega, mille molekulmass ei ületa 400, sest suurema molekulmassiga ained ei anna märgatavat aururõhku liikuvas faasis temperatuuridel, mida gaasikromatograafias kasutatakse. Vedelikukromatograafias aga puuduvad piirangud aine molekulmassile ja on võimalik lahutada ka kõrgmolekulaarsete ainete segusid. Vedelikukromatograafide abil lahendatakse nüüdisajal umbes 20% kõikidest analüütilistest ülesannetest (umbes 60% kromatograafilistes analüüsidest). Seega on vedelikukromatograaf tähtis analüütiline seade, ilma milleta pole mõeldav keskkonnaanalüütika. Tänapäevases vedelikukromatograafias pumbatakse eluenti 20 300 atm rõhu all läbi peeneteralise täidisega
Isoelektriliseks fokuseerimiseks (IEF) nim valkude lahutamist elektriväljas vastavalt nende isoelektrilisele punktile elektriväljas liiguvad valgud niikaua, kuni satuvad piirkonda, kus nende laeng neutraliseerub keskkonna pH mõjul. 2D-elektroforees. Kahesuunalisel elektroforeesil (2D-elektroforees) eraldatakse valgud kõigepealt vastavalt nende laengule (IEF) ja seejärel vastavalt nende molekulmassile (SDS-PAGE). Valgu sõrmejälg. Protein fingerprinting on analüütiline tehnika valgu identifitseerimiseks. Esmalt tundmatu valk lõhutakse väiksemateks peptiidideks, millede absoluutmassi saab täpselt massspektromeetriga mõõta. Neid masse võrreldakse siis andmebaasis olevate tuntud valkude järjestustega. Tulemusi anlüüsitakse statilistiliselt, et leida sobivaim vaste (umbes nii). 4. Mass-spektriomeetria, NMR, röntkenstruktuuri analüüs, peptiidide keemiline süntees.
DNA molekulideks, millest ka nimi kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule saab restriktaasi abil lohustatud DNA molekuli uurida elektroforeetiliselt. Nimelt moodustub restriktaasi toimel DNA molekulist erineva pikkusega fragmente (restriktsiooni fragmendid), millel on ka erinev molekulmass. DNA lohustub nii mitmeks fragmendiks kui mitu vastavat loikepiirkonda temas on. Elektroforeesil agaroosgeelis liiguvad need fragmendid erineva kiirusega asetudes ritta vastavalt molekulmassile. Need fragmendid varvitakse voi margistatakse radioaktiivsete isotoopidega ning maaratakse nende molekulmass. Sel teel saame DNA restriktsioonikaardi e profiili. Selle alusel on voimalik vorrelda erinevate isendite geneetilisi koode ilma NH jarjestust maaramata. Samuti saab maarata naiteks erinevate mikroobituvede geneetilist sugulust, mistottu see on ka molekulaarepidemioloogia uks olulisi meetodeid. NH hubridiseerimine
f) Isoelektriliseks fokuseerimiseks (IEF) – valkude lahutamist elektriväljas vastavalt nende isoelektrilisele punktile – elektriväljas liiguvad valgud niikaua, kuni satuvad piirkonda, kus nende laeng neutraliseerub keskkonna pH mõjul. g) 2D-elektroforees – kahesuunaline elektroforees, kus eraldatakse valgud kõigepealt vastavalt nende laengule (IEF) ja seejärel vastavalt nende molekulmassile (SDS-PAGE). h) Valgu sõrmejälg. Protein fingerprinting on analüütiline tehnika valgu identifitseerimiseks. Esmalt tundmatu valk lõhutakse väiksemateks peptiidideks, millede absoluutmassi saab täpselt massspektromeetriga mõõta. Neid masse võrreldakse siis andmebaasis olevate tuntud valkude järjestustega. Tulemusi anlüüsitakse statilistiliselt, et leida sobivaim vaste. 4. Mass-spektromeetria, NMR, röntgenstruktuuri analüüs, peptiidide
suspensioonidega. Mida ma pean oskama: 1) tõlgendada ja ennustada lähtuvalt aine valemist tema füüsikalisi omadusi, 2) teha arvutusi ideaalgaasi võrrandi abil, 3) teha arvutusi lahuse kontsentratsioonidega, 4) eristada kolloide ja tõelisi lahuseid. 5) hinnata kontsentratsioonist tulenevaid vesilahuste keemis- ja sulamispunktide muutusi. Kasulikke seoseid: MW (molekulmass, a.m.ü.), siit GMW (aine hulk molekulmassile võrdseis grammides), siit EW (ekvivalentkaal) = MW/Z, kus Z on kas 1)iooni laengu absoluutväärtus, 2)H+ või OH– ioonide arv millega antud osake reageerib happe/aluse reaktsioonis või 3)oksüdatsiooniastme muutuse absoluutväärtus red-oks reaktsioonis. Alltoodud pilt illustreerib NaCl kristalli ehitust (näed seal korrapära) ja kristalli lahustumisprotsessi vees. Vt. hoolikalt, see on väga õpetlik!
rekombinant-DNA molekulideks, millest ka nimi kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule saab restriktaasi abil lõhustatud DNA molekuli uurida elektroforeetiliselt. Nimelt moodustub restriktaasi toimel DNA molekulist erineva pikkusega fragmente (restriktsiooni fragmendid), millel on ka erinev molekulmass. DNA lõhustub nii mitmeks fragmendiks kui mitu vastavat lõikepiirkonda temas on. Elektroforeesil agaroosgeelis liiguvad need fragmendid erineva kiirusega asetudes ritta vastavalt molekulmassile. Need fragmendid värvitakse või märgistatakse radioaktiivsete isotoopidega ning määratakse nende molekul- mass. Sel teel saame DNA restriktsioonikaardi e profiili. Selle alusel on võimalik võrrelda erinevate isendite geneetilisi koode ilma NH järjestust määramata. Samuti saab määrata nt erinevate mikroobitüvede geneetilist sugulust. Rekombinant DNA ja DNA kloonimine DNA kloonimise all môistame teatud DNA lôigu paljundamist. Selleks kasutatakse
nelja aromaatset tsüklit sisaldavaid PAH-e nimetatakse “kergeteks” PAH-ideks (näiteks benseen, flouranteen, antratseen) ning rohkem kui nelja aromaatset tsüklit sisaldavaid PAH- e “rasketeks” (näiteks benso(a)püreen). “Rasked” PAH-id on enamasti stabiilsemad kui “kerged” PAH-id. Elusorganismidele mürgiseks loetakse PAH-e, mille molekulmass jääb vahemikku 128,16 kuni 300, 36 g/mol, sest tänu oma madalale molekulmassile on nad keskkonnas liikuvamad kui suurema molekulmassiga PAH-id. Suurema molekulmassiga PAH-id (molekulmass suurem kui 300, 36 g/mol) on vähem liikuvad keskkonnas, sest neil on suurem molekul ning väiksem lendumis- ja lahustumisvõime. Madalama molekulmassiga PAH-id (koosnevad ainult kahest-kolmest benseenituumast) on mõnede organismide jaoks akuutselt toksilised, kuid pole leitud, et nad oleksid kantserogeenid.
annaabi.ee 
