Rakuvaba DNA kloonimine ehk in vitro DNA kloonimine. See on uuem meetod Rakuline DNA kloonimine ehk in vivo kloonimine. Meetod põhineb spetsiifilise DNA fragmendi in vitro sisestamisel iseseisvalt replitseeruvasse DNA järjestusse. Selline replikon viiakse sobivasse peremeesrakku ja paljundatakse seal. Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just seda meetodit. Rakuline kloonimine 1. Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine in vitro-geeni fragment sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva geneetilise elemendi (replikoni), enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi 2. Transformatsioon- selle tulemusena saadakse uus rekombinantneDNA molekul, mis on võimeline sisenema(näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA replikatsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud rakud
loengus. 2. Rakuline DNA kloonimine ehk in vivo kloonimine. Meetod põhineb spetsiifilise DNA fragmendi in vitro sisestamisel iseseisvalt replitseeruvasse DNA järjestusse. Selline replikon viiakse sobivasse peremeesrakku ja paljundatakse seal. Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just seda meetodit. Rakuline kloonimine koosneb neljast põhietapist: 1. Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine in vitro Meile huvipakkuva geeni fragment, e. insert (võõr-DNA), sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva geneetilise elemendi (replikoni), enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi e. vektorisse. 2. Transformatsioon. Selle tulemusel saadakse uus rekombinantne DNA molekul, mis on võimeline sisenema (näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Selektiivne paljundamine. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud rakud
Mahajääv ahel (moodustub praimosoom, süntees fragmentidena) Okazaki fragmendid o RNA praimer (sünteesitakse RNA polümeraasiga) o DNA polümeraas III (viib läbi DNA matriitssünteesi) DNA fragmentide ühendamine o DNA polümeraas I (RNA lõigatakse välja ja tühik sünteesitakse täis) o DNA ligaas (ühendab fragmendid ligeerimisel) o o Esineb DNA polümeraas III kaks katalüütilist tsentrit, kus replitseeritakse DNA liiderahel ning mahajääv ahel. o Praimosoom keerab lahti vanem-DNA kaksikheeliksi ja initsieerib sünteesi RNA praimeritega. o Replikatsioonil liigub vanem-DNA läbi replisoomi. o Replikatsioon toimub 5´ → 3´ suunas. Transkriptsioon o RNA nukleotiidne järjestus on määratud geeni ühe DNA ahela järjestusega
DNA helikaasid (teevad ahelad lahti) SSB valgud (kaitsevad üksikahelalist DNA-d) Ahelate eristamine Liiderahel (pidev süntees DNA püolümeraas III- abil) Mahajääv ahel (moodustub praimosoom, süntees fragmentidena) Okazaki fragmendid RNA praimer (sünteesitakse RNA polümeraasiga) DNA polümeraas III (viib läbi DNA matriitssünteesi) DNA fragmentide ühendamine DNA polümeraas I (RNA lõigatakse välja ja tühik sünteesitakse täis) DNA ligaas (ühendab fragmendid ligeerimisel) 3. Transkriptsioon RNA nukleotiidne järjestus on määratud geeni ühe DNA ahela järjestusega RNA transkript on DNA-lt maha loetud Algne mRNA on pre-mRNA. Pre-mRNA modifitseerimine (Vt geeni struktruur) mRNA-s on informatsioon polüpeptiidi sünteesiks Transkriptoom 4. Geneetiline kood Geneetilise koodi üldiseloomustus Geneetilise koodi spetsiifilised omadused on alljärgnevad: Tripletne. Nukleotiidseks tripletiks mRNA koodonis on kolm nukleotiidi, mis määravad ühe aminohappe
Doonorplasmiid pSTBlue1 vektor koos meie inserdiga Aktseptor plasmiid pEGDP-C Reportergeen EGFP Insert DST Ümberkloneerimiseks kasutatavad restriktaasid BamHI ja SalI Millistel tingimustel restriktsiooni reaktsioon läbi tuleks viia? Millise pikkusega fragmendid saame ja mida kasutame ligeerimisel? Double Digest soovitaks meie reaktsiooniseguks: 16 1x BamHI puhver 1x BamHI 2x SalI Incubate at 37°C Lõigates nii pSTBlue1 vektorit saame eraldada oma inserdi mis on kuskil 700bp ja pEGFP-C vektori lõikamisel lõikame sealt kuskil 20 bp välja ja kasutame ülejäänut pikka vektorit. Millised katsed tuleb teostada, et saaksime kätte 1µg sellist GFP ja sinu kloneeritud valku kodeerivat ekspressioonivektorit? 1
organismis) kloonimine. Meetod põhineb spetsiifilise DNA fragmendi viimisel in vitro sellisesse DNA järjestusse, mis on võimeline iseseisvalt replitseeruma. Selline replikon viiakse sobivasse peremeesrakku ja paljundatakse seal. Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just seda meetodit. Rakuline kloonimine koosneb neljast põhietapist: 1. Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine in vitro. Meile huvipakkuva geeni fragment, e. võõr-DNA, sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva geneetilise elemendi (replikoni), enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi e. vektorisse. 2. Transformatsioon ehk sisestamine. Selle tulemusel saadakse uus rekombinantne DNA molekul, mis on võimeline sisenema (näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Selektiivne paljundamine. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks
Ainult EcoRI-st ei piisa, kuna inserdil on vaid üks EcoRI lõikamissait ühte otsa tuleb töödelda mingi teise restriktaasiga, BamHI sobib kõige paremini, kuna lõikab pärast kodeerivat järjestust. Kuna inserdi algus ja lõpp on erineva restriktaasiga lõigatud, siis see kindlustaks ka selle, et insert siseneb vektorisse õiget pidi. Puhvritest oleks restriktsioonil kõige optimaalsem kasutada sama firma poolt müügilolevat spetsiaalset EcoRI ja BamHI puhvrit, ligeerimisel ligeerimispuhvrit. ii. Jälgida tuleb, et lugemisraam ühtiks sisestatava valku kodeeriva järjestuse lugemisraamiga. Minu kasutatud plasmiidile (L-Envo pEGFP-C2) sobib pEGFP-C2, kuna Kui sisestataval järjestusel pole stopp-koodonit, peab olema stopp-koodon kindlasti vektoris. b) Skemaatiline esitus: Vektor + insert: 9. a. Loomarakke säilitatakse pikemaajaliselt vedelas lämmastikus külmutatuna, lühiajaliselt sobib ka -80oC
peab säilitama oma aktiivsust kõrgel temperatuuril. Taq polümeraasid ei oma proof- reading aktiivsust (3’ – 5’ exonukleaasset aktiivsust), seega neil puudub võime kord valesti lülitatud nukleotiidi õigega asendada. See on tähtis TA-kloneerimisel, kuna meil on vaja, et moodustaksid sobivad restriktsioonisaidid edasiseks kloneerimiseks, kus 3’ otsas on adeniin ja 5’ otsas on tümidiin ning vektori ja inserdi ligeerimisel toimub A-T otste paardumine. 2. Segasin kõik vortexiga, fuugisin ning asetasin segu PCRi masinasse. 3. PCRi programmi kirjutamine: 1. 95 °C 15 minutit – polümeraasi aktiveerimine 2. 95 °C 10 sekundit – DNA ahelate denatureerimine 3. 56 °C 20 sekundit – praimerite seondumine DNAle (annealing) 4. 72 °C 3 minutit – DNA süntees 5. Kordamine alates 2. punktist 21 korda 22. Selline sünteesiaeg valitakse sõltuvalt polümeraasist
DNA-viivisahelal sünteesitud fragment (prokarüootidel 1000–2000 ja eukarüootidel 100–200 bp), mis koosneb lühikesest RNA praimerist ja järgnevast DNA-polünukleotiidist. Okazaki fragmendid: RNA praimer (sünteesitakse RNA polümeraasiga) ja DNA polümeraas III (viib läbi DNA maatritssünteesi) DNA fragmentide ühendamine: DNA polümeraas I (RNA lõigatakse välja ja tühik sünteesitakse täis) ja DNA ligaas (ühendab fragmendid ligeerimisel) 13. Histoonide tüübid Histoonid on väiksed aluselised valgud (koosnevad 102–135 aminohappest), mida leidub eukarüootide tuumas.[1] Need on põhilised kromatiini valgud, mille ümber keerdub DNA ja need mängivad suurt rolli geenide regulatsioonis. Histoonide funktsiooniks on osaleda DNA kokkupakkimisel, et viimane mahuks rakutuuma. Näiteks inimese iga rakk sisaldab lahtikeeratult umbes 1,8 meetrit
annaabi.ee 
