DNA replikatsioon 1. Alternatiivsed mudelid 2. Poolkonservatiivne: MeselsonStahli katsed 3. DNA süntees ja elongatsioon 4. DNA polümeraasid 5. Replikatsiooni algus ja initsiatsioon 6. Prokarüootne/eukarüootne mudel (tsirkulaarne/lineaarne kromosoom) 7. Telomeeride replikatsioon Replikatsiooni alternatiivsed mudelid Ultratsentrifuugimine gradiendis 1958: Matthew Meselson ja Frank Stahli katse, milles näidati, et repliktsioon on poolkonservatiivne 1955: Arthur Kornberg Töötas E. coli'ga. Avastas DNA sünteesi mehhanismi in vitro Vajalik neli komponenti: 1. dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP (deoxyribonukleosiid 5'trifosfosfaadid) (suhkuralus + 3 fosfaati) 2. DNA matriits 3. DNA polümeraas I (Kornbergi ensüüm) (DNA polymeraas II ja III avastati veidi hiljem) 4. Mg 2+ (optimeerib polümeraasi aktiivsuse)
I. Fikseerimine II. Etanooliga veetustamine III.Ksüleeni immutamine IV. Paraffiini sisestamine Fikseerimine kindlustab kudedes toimuvate surmajärgsete muutuste ärahoidmise ja aitab kaasa tervikliku struktuuri säilitamisele. Selleks, et koetükki hüdrofoobsesse paraffiini panna, tuleb seda enne hüdrofoobsesse lahustisse immutada ehk kõigepealt hüdrofiilsest veest lahti saada. Seega, järgmiseks etapiks on koe etanooliga veetustamine ehk vee eemaldamine kude kasvavas etanooli gradiendis (50-100% etanooli) inkubeerides. Järgmisena, etanool asendatakse hüdrofoobsema lahusti ksüleeniga. Ksüleen on hüdrofoobne lahus, mis seguneb nii paraffiini kui ka etanooliga. Ja alles pärast ksüleeniga immutamist kude võib sulanud paraffiini sisestada. Pärast paraffiini tardumist kude lõigatakse õhukesteks lõikudeks, mis pannakse alusklaasile ja edasi värvitakse. 2. Elusrakkude värvimise põhietapid (iga etapi eesmärk).
esindatud nii positiivselt kui negatiivselt laetud rühmad, eksisteerib ka pH väärtus, mille juures molekulide keskmine laeng on null ehk molekulil esineb isoelektriline punkt. Kui molekulis domineerivad happelised rühmad on pI madal, kui aga domineerivad aluselised rühmad on pI kõrge. Konkreetse valgu pI väärtus on seda valku iseloomustavaks suuruseks. Amfolüütide ja polüamfolüütide pI on võimalik määrata eksperimentaalselt. Selleks kasutatakse elektroforeesi pH gradiendis ja seda nimetatakse isoelektriliseks fokuseerimiseks. Elektrivälja toimel amfolüütide lahusele hakkavad summaarset positiivset laengut kandvad molekulid liikuma katoodile (katioonid liiguvad katoodile) ja negatiivset kogulaengut kandvad molekulid liiguvad anoodi suunas (anioonid liiguvad anoodile). Isoelektrilises punktis on molekulide keskmine laeng null ja seetõttu nad elektriväljas ei liigu. Kuna elektroforees viiakse
Joonisel 3.2 saab näha seda sõltuvust mõnede mittenjuutonlike vedelike korral. 5 3 4 6 1 7 d 2 dn Joonis 3.2. Nihkepinge sõltuvus kiiruse gradiendis järgmistel objektidel: 1 Newtoni vedelik; 2 ideaalne fluidum; 3 elastne tahke keha; 4 Binghami vedelik; 5 Herschel- Buckley vedelik; 6 pseudoplastiline vedelik; 7 dilantne vedelik. Järgnevalt käsitleme joonisel mainitud mitte-njuutonlike fluidume. Ideaalne vedelik (kõver 2) on vedelik, millel puudub sisehõõrdumine; võrdluseks, elastses tahkes kehas (kõver 3) ei teki kiiruse gradienti, kuna kogu nihkepinge kandub edasi. Kõver
c) Värvimine saab teha looduslike, sünteetiliste värvidega, ka olmevärvidega (tint & tuss). Aluselise reaktsiooni värvid värvivad tuuma, happelise reaktsiooniga aga tsütoplasma. II. Tsentrifuugimine Eesmärk on raku erinevate struktuuride laialijaotamine tihedusgradiendis. Uuritavate rakustruktuuride segu allutatakse raskusjõu kiirendusele. Mida suurem on struktuurmass, seda pikema tee nad selles gradiendis läbivad. Saab eraldada tuumade, plastiidide, mitokondrite, ribosoomide ja membraanide fraktsioone. III. Radioautograafia Radioaktiivsete isotoopide kasutamine eesmärgiga kindlaks teha teatud ainete sünteesi koht ja aktiivsus. Radioaktiivne isotoop viiakse elupuhusesse koekultuuri, võetakse proov, see fikseeritakse radioaktiivne isotoop tuvastatakse (kasutatakse kas fotoemulsioonmeetodit (AgCl) või spetsiaalseid radioaktiivseid loendureid. IV
c) Värvimine saab teha looduslike, sünteetiliste värvidega, ka olmevärvidega (tint & tuss). Aluselise reaktsiooni värvid värvivad tuuma, happelise reaktsiooniga aga tsütoplasma. II. Tsentrifuugimine Eesmärk on raku erinevate struktuuride laialijaotamine tihedusgradiendis. Uuritavate rakustruktuuride segu allutatakse raskusjõu kiirendusele. Mida suurem on struktuurmass, seda pikema tee nad selles gradiendis läbivad. Saab eraldada tuumade, plastiidide, mitokondrite, ribosoomide ja membraanide fraktsioone. III. Radioautograafia Radioaktiivsete isotoopide kasutamine eesmärgiga kindlaks teha teatud ainete sünteesi koht ja aktiivsus. Radioaktiivne isotoop viiakse elupuhusesse koekultuuri, võetakse proov, see fikseeritakse radioaktiivne isotoop tuvastatakse (kasutatakse kas fotoemulsioonmeetodit (AgCl) või spetsiaalseid radioaktiivseid loendureid. IV
skalaarv¨ alja f gradientv¨ aljaks. Omadus 1. Olgu s vektor ruumis Rm . Siis kehtib valem gradf (P ) · s fs (P ) = . (6.38) |s| Erijuhul |s| = 1 taandub valem (6.38) kujule fs (P ) = gradf (P ) · s . (6.39) Omadus 2.Tuletis vektori s suunas on maksimaalne siis, kui s on gradiendis- uunaline. Sellisel juhul fs (P ) = |gradf (P )|. Omadus 3. Olgu u = f (x, y, z) kolmemuutja funktsioon ja A punkt tema m¨ a¨ aramispiirkonnas. Vektor gradf (A) on funktsiooni f nivoopinna normaalvek- tor punktis A. Teiste s~ onadega: gradf (A) ristub punkti A l¨abiva nivoopinna f (x, y, z) = C puutujatasandiga punktis A. Tuletis funktsiooni u = f (x, y, z) nivoopinna puutuja suunas v~ ordub nulliga. 22) Nabla
üle 50 erinevast ribosoomivalgust. Transkriptsioon – rakutuumas. Translatsioon – tsütoplasmas. Bakterirakus ei ole ribosoomidel kindlat asukohta. 64. Ribosoomide ehitus prokarüootses ja eukarüootses rakus. Ribosoomid koosnevad suurest ja väiksest alaosast ehk subühikust, milles sisalduvad rRNA ja valgud. Ribosoomi komponentide suurust väljendatakse tavaliselt Svedbergi ühikutes, mis vastab nende komponentide sedimentatsiooni kiirusele tseesiumkloriidi gradiendis tsentrifuugimisel. Bakterirakus asuvad ribosoomid on suurusega 70S. Eukarüootide tsütoplasmas asuvad ribosoomid on suurusega 80S. Bakteri ribosoomide väike subühik suurusega 30S koosneb 16S rRNA molekulist ja 21-st erinevast polüpeptiidist. Suur subühik (50S) sisaldab kahte RNA molekuli (5S rRNA ja 23S rRNA) ning 31 erinevat polüpeptiidi. Eukarüootsed ribosoomid koosnevad 40S väiksest subühikust, milles on 18S RNA ja 33 erinevat ribosoomivalku ning 60S
märgistatud kordusjärjestusega. Fluorestsentsvärvidega märgitud hübridisatsiooniproovide kasutamise puhul nimetatakse protseduuri FISH-iks (Fluorescent In Situ Hybridization). Renaturatsiooni käigus paarduvad DNA ahelad komplementaarsusprintsiibil ning märgistatud üksikahelaline DNA hübridiseerub talle homoloogiliste piirkondadega kromosoomis. FISH-i abil on demonstreeritud näiteks kordusjärjestuse TTAGGG paiknemine telomeerides. DNA tsentrifuugimisel CsCl gradiendis on võetud kasutusele mõiste "satelliit-DNA". Satelliit-DNA puhul on tegemist kordusjärjestustega, mille A:T ja G:C paaride suhe erineb oluliselt ülejäänud genoomi A:T ja G:C paaride suhtest. Sellised DNA-d sukelduvad võrreldes ülejäänud genoomse DNA fragmentidega CsCl gradienti erinevalt (A:T paaride-rikas DNA on väiksema tihedusega kui G:C paaride-rikas DNA) ning seetõttu on tsentrifuugitopsis lisaks põhilisele DNA fraktsioonile eristatavad veel diskreetsed minoorsed fraktsioonid
märgistatud kordusjärjestusega. Fluorestsentsvärvidega märgitud hübridisatsiooniproovide kasutamise puhul nimetatakse protseduuri FISH-iks (Fluorescent In Situ Hybridization). Renaturatsiooni käigus paarduvad DNA ahelad komplementaarsusprintsiibil ning märgistatud üksikahelaline DNA hübridiseerub talle homoloogiliste piirkondadega kromosoomis. FISH-i abil on demonstreeritud näiteks kordusjärjestuse TTAGGG paiknemine telomeerides. DNA tsentrifuugimisel CsCl gradiendis on võetud kasutusele mõiste "satelliit-DNA". Satelliit-DNA puhul on tegemist kordusjärjestustega, mille A:T ja G:C paaride suhe erineb oluliselt ülejäänud genoomi A:T ja G:C paaride suhtest. Sellised DNA-d sukelduvad võrreldes ülejäänud genoomse DNA fragmentidega CsCl gradienti erinevalt (A:T paaride-rikas DNA on väiksema tihedusega kui G:C paaride-rikas DNA) ning seetõttu on tsentrifuugitopsis lisaks põhilisele DNA fraktsioonile eristatavad veel diskreetsed minoorsed fraktsioonid
merevees üsna püsiv. Hepatiit E , gastroenteriit, kõhulahtisus. Defensiinid Imetajatel, Putukatel, Taimedel. Kõik kes vahepeale jäävad. Väiksed valgud, kaitsevad bakterite ja viiruste eest edukalt. Opsoniseerivad – märklaua märgistamine, mis on vaja kõrvladada, beeta defesniiniga, anitkeha seostumisegaa, komplemendiga, kui tulevad fagotsüüdid siis opsoniseeritud materjal kiirelt fagotsüteeritakse. Kemotaktilised, gradiendis võivad dentriitarkud liikuda nt Histamiinid midagi?? Raku kasvu muutmine Märklaudu otseselt hävitada. Mõningad defensiinid on ajas muutunud veidral moel. Mürgised imetajad. Kuubalt ja Haitilit – Solendon cubanus – putuktoiduline, süljenäärmetesse suudavad sünteesida mürgist sülge, hammustavad loomi ja need kangestuvad. Ka isased nokkloomad omavad mürginääret, tagakäpa eraldi küünis. Olemuselt on mürgid beeta-defensiinid.
rakkude kloonimine · Geneetiliselt homogeenne rakutüvi - kloon Puudused: ei saa jälgida organismi kui tervikut. Eritüübilised rakud on erinevad: · väljanägemiselt ja suuruselt · kaalult · laengult · tiheduselt · antigeensuselt jne. Osa erinevusi on võimalik kasutada teatud tüüpi rakkude eraldamiseks teistest rakkudest. Rakkude eraldamise enamlevinud meetodid: · tsentrifuugimine; tsentrifuugimine gradiendis · afiinsusel põhinevad meetodid; magnet · FACS 2. Mikroorganismide kasvatamine kultuuris. · Escherichea coli, Saccaromyces cerevisiae · Kiire kasv ja väga lihtne kasvukeskkond · süsiniku allikas: glükoos või glütserool · lämmastiku allikas: NH4+ · soolad: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, SO42-, Cl-, PO43- 51 3. Mikroorganismide kasvukeskkond kultuuris.
annaabi.ee 
