Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis kolonnis, mis on täidetud pundunud geelgraanulitega, mille poorid on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide mõõtmetega. Geelkromatograafias kasutatakse geele, mis koosnevad dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad mahud: · kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht) VV · graanulitesisese vedeliku maht VS · geelmaatriksi maht Vg · täidise kogumaht Vt Kui kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele ehk vastavalt võimele difundeeruda geeli pooridesse. Kolonni voolutatakse sobiva vesilahusega, et ainete segu läbi kolonni transportida. Kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimismaht V x. Kui
katseklaas. Käsitsi tuleb lisada nii eluenti kui ka fraktsioone koguda. Ainete kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kolonn asetataksse statiivile vertikaalselt · Kolonni täidise mark ja seda iseloomustav tegur k märgitakse üles. · Mõõdetakse geeli kõrgus L ja diameeter d. · Arvutatakse geeli kogumaht Vt. · Arvutatakse geelmaatriksi maht Vg ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, võttes ühe fraktsiooni mahuks 2 ml. · Katseklaasistatiivi asetatakse arvule n vastav katseklaaside hulk, nummerdatakse. · Valmistatakse ette voolutuslahus ja leitakse sobiv pipett lahuse kolonni viimiseks. · Varutakse väike keeduklaas, kuhu kogutakse geeli pinnal olev eluent. Segu komponentide lahutamine
Et segu läbi kolonni transportida ning erineva molekulmassiga ained lahutada voolutatakse seda sobiva vesilahusega ning kogutakse eluaati kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Töö käik Ettevalmistus · Töös kasutasin geeli Sephadex G-75 ning tema fraktsioneerimispiirkond on 3000-80000D, k = 0,1 · Täidise kõrguseks mõõtsin L = 32cm ja läbimõõduks d = 1,7cm -> r = 0,85cm · Arvutasin täidise kogumahu: Vt = L·r2= 32 · 0,852 = 72,63cm3 · Arvutasin geelmaatriksi mahu: Vg = k·Vt = 72,63 · 0,1 = 7,263cm3 ja maksimaalse eludeerimismahu Vxmax = Vt Vg = 72,63 7,273 =65,357 cm3 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu teades, et ühe fraktsiooni maht on 2ml. n = Vxmax/2 = 65,357 / 2 33 · Nummerdasin katseklaasid Praktiline töö · Avasin kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt tilkuma keeduklaasi. · Reguleerisin kolonni voolutuskiiruseks ligikaudu 1ml/min
käesolevas töös spektromeetrilist meetodit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine. Kolonni täidiseks oli SephadexG75 ning seda iseloomustav tegur k, mis sõltub kasutatava geeli pundumisastmest, oli 0,1. Geelisamga kõrgus L oli 22,2 ja diameeter d oli 1,8 Täidise kogumaht Vt= r 2 * L = *( 1,8/2)2 * 22,2= 56,46 Geelmaatriksi maht Vg= k*Vt= 0,1 * 56,46= 5,6 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg = 56,46 5,6=50,86 Fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni maht on 2ml, seega n=Vxmax/2 =50,86/2=25,2 Katseklaasistatiivi asetasin 25 nummerdatud klaasi, kus olid eelnevalt tehtud 2ml piirid. Voolutuslahuseks ehk eluendiks oli 0,15M NaCl, eluendi kolonni viimiseks kasutasin 10ml pipetti. 50ml keeduklaasi kogusin kolonni täidise pinnal oleva eluendi.
Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone polnud vaja mõõta. Tulemused esitati kromatogrammina. TULEMUSED JA NENDE INTERPRETATSIOON Täidise mark SEFADEX G-75 Pundumistegur k 0,1 Täidise kõrgus L 31,5 cm Kolonni sisediameeter d 1,8 Täidise kogumaht ( ) Geelmaatriksi maht Maksimaalne elueerimismaht Fraktsioonide üldarv Dekstraansinine Uuritav segu Müoglobiin DNP-aspartaat pH 7,5 Elueerimislashus 0,05 M Tris/HCl 0,1 M NaCl Laine- Fraktsiooni Eluaadi Optiline
4) Vt täidise kogumaht ehk üldmaht. On arvväärtuselt lähedane maksimaalse elueerimismahuga Vxmax. Töö käik Kolonni iseloomustamine Kasutusel on geelkromatograafia kolonn nr 3 (aknast kõige kaugemal). Kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark G-75 k = 0,1 Fraktsioneerimispiirkond: 3000 80000 D Materjal: dekstraan Täidise kõrgus L = 33 cm Täidise diameeter d = 1,8 cm ; r = 0,9 cm Täidise kogumaht Vt = r 2 L = 0,9 2 33 = 83,98cm3 Geelmaatriksi maht Vg = k Vt = 0,1 83,98 = 8, 40cm3 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt - Vg = 83,98 - 8, 40 = 75,58cm3 Fraktsioonide üldarv V max 75,58 n= x = = 37, 78 38 2 2 Voolutuslahuse koostis 50 mMTris-HCl 150 nM NaCl pH = 7,5 Uuritava proovi koostis Dekstraansinine (sinine) Müoglobiin (pruun) DNP-aspartaat (kollane) Töö kolonniga Kõigepealt avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et voolutuslahuse nivoo oleks võrne
Elueerimine lõpetatakse kui väljub viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsiti spektrofotomeetritel neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, milles järeldub lahuse optiline tihedus. Tulemuste põhjal koostati kromatogramm. Tulemused ja nende analüüs Täidise mark: SEPHADEX G-75 Pundumistegur k = 0,1 Täidise kõrgus L = 32,5 cm Kolonni diameeter d = 2,1 cm r =1,05 Täidise kogumaht: Vt= ·r2·L = 3,14 · 1.052 · 32,5 = 112,5 cm3 Geelmaatriksi maht: Vg= 0,1 · 112,5 = 11,25 cm3 Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 112,5 11,25 = 101,26 cm3 Fraktsioonide üldarv: n=101,26 : 2 = 50, 63 51 Uuritav segu: Dekstraansinine 3mg/ml Müoglobiin: 5mg/mol DNP-aspartaat: 0,3 mg/mol Elueerimislahus: pH= 7,4 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl Fraktsiooni nr Lainepikkus, nm Elueerimismaht V, Optiline tihedus, ml A
Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja vajadusel korrigeerisin kolonni asendit. · Märkisin ples kasutatava kolonni täidiseks oleva Serphadex'i margi ja seda iseloomustava teguri k. Sephadex'i mark: Tegur k: · Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrguse L ja diameetri d. Täidise kõrgus: Täidise diameeter: · Arvutasin täidise kogumahu . · Arvutasin geelmaatriksi mahu ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu . · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml. · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerasin. · Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ja märkisin üles eluendi koostise. Varusin 25 ml pipeti, millega voolutuslahust kolonni viia.
sai seda loksutatud ning lastud sellel uuesti settida. o Märkisin ülesse kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i margi Sephadex G-75 ja seda iseloomustava teguri k=0,1. o Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrguse l=32 cm ja diameetri d=1,6 cm, kasutades sobivat joonlauda. o Arvutasin täidise kogumahu Vt = Vv + Vs + Vg = PI*(d/2)2*l = 64 cm2. o Arvutasin geelmaatriksi mahu Vg = k*Vt = 0,1*6,4= 6,4 cm2 ja sellest lähutvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 64cm2 6,4 cm2 = 57,6 cm2. o Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n= Vxmax/2 = 57,6/2 =~29. o Katseklaasistatiivile asetasin fraktsioonide arvule (29) vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin.
annaabi.ee 
