tõttu: - pindadsorptsioon, - suhteline lahustuvus, - laeng. kromatograafia on meetod, mille abil saab segusid üksikuteks komponentideks lahutada, teostatakse kolonnis, mis on täidetud statsionaarse (liikumatu) faasiga. Kromatograafilise lahutamise pôhiidee : mitmekordne sorbtsioon/desorbtsioonMobiilne faas e. eluentStatsionaarne faas e. kolonni täidismaterjalAine retensiooniruumala ; mobiilse faasi ruumala, mis on vajalik poole aine koguse elueerimiseks kolonnist Kromatograafia tüübid: Ioonvahetus kromatograafia: *Komponendid liiguvad piki kolonni, rohkem kinni peetud komponent asendab vähema. *Näiteks vee pehmendamine, ioonvahetuskolonniga; *ei saa komponente täielikult lahutada; *kolonni pikendamine ei mõju -Gaaskromatograafia: -Vedelikkromatograafia (LC): A on väga väike, B ja C on väikesed, sest vedelikes on difusioon palju väiksem kui gaasides. -Elektroforees:Meetodid: Paber-, geel-, kapillaarelektroforees
- pindadsorptsioon, - suhteline lahustuvus, - laeng. kromatograafia on meetod, mille abil saab segusid üksikuteks komponentideks lahutada, teostatakse kolonnis, mis on täidetud statsionaarse (liikumatu) faasiga. Kromatograafilise lahutamise pôhiidee : mitmekordne sorbtsioon/desorbtsioonMobiilne faas e. eluentStatsionaarne faas e. kolonni täidismaterjalAine retensiooniruumala ; mobiilse faasi ruumala, mis on vajalik poole aine koguse elueerimiseks kolonnist Kromatograafia tüübid- Ioonvahetus kromatograafia: Komponendid liiguvad piki kolonni, rohkem kinni peetud komponent asendab vähema. Näiteks vee pehmendamine, ioonvahetuskolonniga; ei saa komponente täielikult lahutada; kolonni pikendamine ei mõju Gaaskromatograafia: Vedelikkromatograafia (LC): A on väga väike, B ja C on väikesed, sest vedelikes on difusioon palju väiksem kui gaasides. Elektroforees: Meetodid: Paber-, geel-, kapillaarelektroforees
Standardne voolukiirus: 70 l/min Lainepikkus: 280 nm Saasteainete identifitseerimine: Orgaaniliste ainete identifitseerimine vees on keeruline protseduur. Konkreetset ainet on väga lihtne identifitseerida, kui on olemas autentne võrdlusaine ehk standardaine. Selleks süstitakse vedelikkromatograafi uuritav proov ning standardlahused. Edasi võrreldakse kromatogrammil proovi ja standardlahuste retentsiooniaegu. Retentsiooniaeg on aeg, mis on vajalik ½ aine koguse elueerimiseks kolonnist. Ainete retentsiooniajad on põhimõtteliselt individuaalsed, s.t. et piigi retentsiooniaja järgi saab kindlaks teha aine, mis sellele piigile vastab (joon. 1). Joon. 1. Tüüpiline kromatogramm Saasteainete kvantitatiivne määramine: Saasteainete kvantitatiivse sisalduse määramiseks kasutatakse välisstandardmeetodeid, kus kaliibrimine teostatakse välisstandardlahustega. Selleks süstitakse kolm standardlahust erineva
Jahutasin vedeliku jäävannis. Kokku sain 9 ml lahust. Lisasin 3ml kloroformi, loksutasin 3 minutit ning tsentrifuugisin, eraldasin Pasteuri pipetiga alumise kloroformikihi. Kordasin ekstraktsiooni 2 korda 2,5 ml kloroformiga. Ühendasin kloroformikihid. Kuivatasin kloroformilahuse 1-2g Na2SO4-ga. 2. Ekstrakti koostise analüüsimine TLC meetodil Analüüsisin ekstrakti TLC meetodil, standarditena kasutasin kofeiini (2mg/ml), teofülliini (2ml/mg) ja teobromiini (0,5mg/ml). Elueerimiseks kasutasin CHCl3:C2H5OH (9:1) lahust. Vaatlesin plaati UV valguses. Kuna mingil põhjusel TLC plaat ei tulnud välja, kordasin katset, kuid plaat jooksis siiski viltu. Teiselt plaadilt on siiski võimalik järeldada, et suure tõenäosusega on tegemist kofeiiniga, kusjuures kontsentratsioon on kõrgem, kui standardil, st >2 mg/ml. 3. Eraldatud ainete koguse määramine Kallasin kloroformilahuse Na2SO4 kristallidelt keeduklaasi, aurutasin nõrgal kuumusel
tööstuses ja naftaproduktide analüüsil. 24. Vedelikkromatograafia põhimõte Mobiilseks faasiks on vedelik, sobib kõikidele analüütidele mis lahustuvad vedelas faasis (bioloogilised ained, anorgaanilised ühendid), retsensioon sõltub interaktsioonidest nii mobiilses kui ka statsionaarses faasis. Statsionaarse faasina kasutatakse väga peeneteralisi kromatograafilise kolonni täidiseid. Peeneteraalise täidise suure takistuse tõttu tuleb proovi elueerimiseks läbi kolonni kasutada survepumpa. 25. Madalefektiivne ja kõrgefektiivne VK (milles seisneb erinevus) Madalefektiivne-VK: madal lahutuvus, laiad piigid, pikk analüüsiaeg. Lihtne konstruktsioon, odav. Täidetud suurte osakestega, kasutatakse madalat rõhku. Kõrgefektiivne-VK: kõrge lahutuvus, kitsad piigid, lühike analüüsiaeg. Keeruline aparatuur ja kallis. Lahutuskolonnid on pakitud peenikeste osakestega, kasutab opereerimisel kõrget rõhku ja suuremaid vooluskiiruseid. 26
kahe aine retentsiooniajad ja kitsamad nende piigid. Efektiivsus - kolonni iseloomustav suurus, mis sõltub piigi retentsiooniajast (aeg, mis kulub ainel kolonni läbimiseks (sissesüstimise hetkest detektorini jõudmiseks)) ja laiusest; Kuidas avaldub seos elueeruva aine retensiooniruumala tema jaotuskoefitsiendi (mobiilses ja statsionaarses faasis) kaudu Retensiooniruumala – mobiilse faasi ruumala, mis on vajalik ½ aine koguse elueerimiseks (väljaviimiseks) kolonnist; CS ( ) V R =V M + V =V M + K V S CM S Cs – konts statsionaarses faasis; Cm – mobiilses faasis Vr – retensiooniruumala; Vm – mobiilse faasi ruumala; Vs – stats.faasi ruumala K – koefitsient. Aine tsooni laiust määravad faktorid kapillaar ja pakitud kolonnides Pakitud kolonnides - molekulide erinevad teepikkused, kuna
2. Inkubeerisin 37 °C juures 5 minutit, et geelitükk oleks täielikult sulanud 3. Pipeteerisin segu kolonni, mis on omakorda kogumistopsis. Tsentrifuugimine – 30 sek, et kogu lahus jookseks läbi kolonni. Visasin läbivoolatud puhver kolonnist ära. 4. Pipeteerisin peale 200 μl pesupuhvrit. Fuugimine – 30 sek, visasin läbivoolatud puhver kolonnist ära (seda etapi tuleb korrata 2 korda) 5. Järgmisena pipeteerisin kolonni keskele 10 μl MQ vett (elueerimiseks). Vett saab kasuta ainult juhul, kui selle pH > 6,0. 6. Jälle fuugimine 1 minuti jooksul – praimerite, nukleotiidide ja erinevate soolade eraldamine. Epsis on elueerinud PCRi produkt, mis on valmis edasiseks ligeerimiseks. 37. 38. 39. 40. Kontrollgeeli pilt. Oodatav produkti pikkus – 700 aluspaari, pildil on näha, et umbes nii see ongi. 41. 42.Rekombinantse plasmiidi ligeerimine 43
kolonni (mis oma korda koosneb kolonnist ja kogumistopsist. Kolonn sisaldab ränifiltri, läbi mille me laseme oma segu jooksma. DNA seostub räniiksiidi osakestega, sellega ta ei saata kogumistopsi, vaid jääb kolonni filtri peale. Kolonni saagis minu DNA lõigule on vahemikus 70-90%) ja tsenrifugeerisime 30sek ja viskasin läbivoolatud puhver välja. 5. Lisasin 200µl pesupuhvrit ja jalle fuugisin 30 sek x2 korda, et olla kindel, DNA on puhas. 6. DNA elueerimiseks kasutasime MQ vett, mille pH oli > 6.0 (teisel juhul, DNA võib kahjustuda). Panin 10µl MQ vett peale ja fuugisin 1 min jooksul. DNA vabanes ränioksiidist ja sai kogumistopsiku sisse. 7. Kontrollin, kas eluaat sisaldab minu DNA lõiku, või puhastamise jooksul tekkisid vead: segasin kokku 1,8 µl DNA värvi, µl MQ H2O ja µl eluaati, ning panin jooksma kontrollgeelile (kokku on 10,8 µl). Kontrollgeeli pilt
Kontsentratsioon 3 mg/ml. Proovi lahustina kasutatakse 0,15 M NaCl lahust 0,5 M sahharoosi lisandiga. Sahharoosi (Mr = 342) lisatakse tiheduse suurendamiseks, et proov moodustaks kolonni sisestamisel geeli pinnale vooluti alla õhukese kihi. Kolonni voolutamine toimub 0,15 M NaCl lahusega. Variant B kolmekomponentne proov. 1. Dekstraansinine (Mr = 2 · 106), 2 mg/ml 2. Broomfenoolsinine (Mr = 670), 40 g/ml 3. Uuritav valk, 10 mg/ml Proovi lahustina ja kolonni elueerimiseks võib kasutada 0,15 M NaCl lahust. Kui kasutatav kolonn on eelnevalt kaliibritud valkudega, milliste molekulmassid on teada, siis on võimalik uuritavas proovis sisalduvat valku molekulmassi järgi kindlaks teha. Olgu näiteks toodud variant, kus uuritava segu lahutamine on läbiviidud Sephadex G-100 kolonnis. Valkude jaoks on selle geeli eksklusioonipiirkond umbes 100 000. Sellisel juhul saab uuritavas segus sisalduva tundmatu valgu identifitseerimiseks kasutada tabelis
annaabi.ee 
