Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8% lahus – 0,67 ml Polümerisatsioonireaktsiooni katalüseerimiseks: TEMED – 4 µl tõmbekapi all APS – 40 µl 4. Valasime kontsentreeriva geeli lahutava geeli peale, eelnevalt kontrollides lahutava geeli polümeseerimist, ning ettevaatlikult panime paika kammi. Jätsime geel polümeriseeruma. Vlaguproovide valmistamine: 1. Segasime omavahel valgulahus ja 2x laadimispuhver, mille komponendiks on broomfenoolsinine – värv, mis aitab jälgida proovide migreerumist (15 µl valgulahus + 15 µl laadimispuhvri) eppendorfis. 1. Trüpsin 23,8 kDa 2. EPGluC 29 kDa 3. Laktaat dehüdrogenaas 35 kDa 4. HRP 44 kDa 5. Ovalbumiin 44,3 kDa 6. BSA 66,3 kDa 7. Tundmatu valk X kDa 2
Forees 1. Kandsime ettevalmistatud valguproove ettevaatlikult geelitaskutesse (20 l). Protokollisime, millisesse taskusse, millise proovi kandsid. 2. Asetasin foreesivannile kaasi, ühendasime juhtmed vooluallikaga ning lülitasime vooluallikas sisse (pinge 180V, voolutugevus 30 mA). NB! Täida elektriaparaatidega töö ohutuseeskirjasid! 3. Foreesi viiakse läbi üldjuhul niikaua, kuni markerina kasutatav broomfenoolsinine on geeli lõpuni jõudnud (tavaliselt ~1 tund 180 V juures). Elektroforeesi kulgu tuleb jälgida ning tuleb veenduda, et geel üle ei kuumeneks (alanda pinget 150V-ni). 4. Lülitasime foreesiaparaat elektrivõrgust välja, kogu puhvrivannidest puhver kokku ja valasime tagasi puhvri pudelisse, võtsime geeli aparaadist välja, eraldasime klaasplaadid teineteisest väga ettevaatlikult kasutades väikest spaatlit. 5. Panime geeli ööseks Coomassie G250 värvilahusesse. 6
130µl 120µl 20µl 10µl 60µl 60µl 50µl 20µl Hindaksin oma täpsust rahuldavaga. Kindlasti kogemusega see paraneb. 2 III HARJUTUS Eesmärk: Harjutada iga pipeteerimiskorraga sama mahtu pipeteerima. Materjalid: Broomfenoolsinine Äädikhappe lahus Blotipaber Pipetid PCR plaat Töö käik: Pipeteerin plaadi nelja auku 100µl broomfenoolsinist Pipeteerin lisaks vastavalt 50µl; 5µl; 0,5µl äädikhappe lahust. Pipeteerin blotipaberile oma nime ja harjutuseks täpikesi Tulemus: Tulemus ei olnud väga imeline, kuna algselt ma ei pannud tervet pipetitäit üheks täpiks vaid jagasin selle kaheks. See on aga harjutuse eesmärgiga vastuolus
Lahus III (5 M KOAc), säilit 4 oC juures) propanool TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2) Ribonukleaas A TE-s (5 g/ml,; Sigma) Fenool, tasakaalustatud TE-ga (NB! Fenooli pipeteerida ainult kummikinnastes ja tõmbe all!). 70% ja 95% Etanool. 1 M Na-atsetaat (NaOAc), pH 5,5 (lisatakse DNA sadestamiseks) Agaroos (FMC) 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2) 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (5 x TBE, 20% glütserool, 0,01% Broomfenoolsinine) EtBr 5 g/l (pipeteerida kummikinnastega, kantserogeenne) NB! Enne tööle asumist lugeda läbi fenooli ja etiidiumbromiidiga töötamise ohutuseeskiri (http://geen.ttu.ee/?id=10705, vt punkt C6. Fenooli ja etiidiumbromiidiga (EtBr) töötamine). Töö käik: 7 (1) Vala ~1,4 ml bakteri ON kultuuri tuubi, sule tuub ja tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 1 min. Tuubid
Lahus III (5 M KOAc), säilit 4 oC juures) propanool TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2) Ribonukleaas A TE-s (5 g/ml,; Sigma) Fenool, tasakaalustatud TE-ga (NB! Fenooli pipeteerida ainult kummikinnastes ja tõmbe all!). 70% ja 95% Etanool. 1 M Na-atsetaat (NaOAc), pH 5,5 (lisatakse DNA sadestamiseks) Agaroos (FMC) 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2) 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (5 x TBE, 20% glütserool, 0,01% Broomfenoolsinine) EtBr 5 g/l (pipeteerida kummikinnastega, kantserogeenne) NB! Enne tööle asumist lugeda läbi fenooli ja etiidiumbromiidiga töötamise ohutuseeskiri (http://geen.ttu.ee/?id=10705, vt punkt C6. Fenooli ja etiidiumbromiidiga (EtBr) töötamine). Töö käik: 6 (1) Vala ~1,4 ml bakteri ON kultuuri tuubi, sule tuub ja tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 1 min. Tuubid asetada tsentrifuugi nii, et tuubi ja kaant ühendav osa jääks väljapoole.
Töö käik: 1. Hindasin silmaga mitu μl vett igas tuubis Minu tulemused: 1. 200 μl (korras) 5. 20 μl (tegelikult 5 μl) 2. 60 μl (korras) 6. 75 μl (korras) 3. 100 μl (korras) 7. 50 μl (tegelikult 35 μl) 4. 30 μl (tegelikult 10 μl) 8. 125 μl (tegelikult 150 μl) 9. 10. 11. 12. Täpsuspipeteerimine 13. Vajalikud materjalid: broomfenoolsinine, äädikhappelahus, blotipaber, pipetid, 200-μl aukudega plaat 14. 15. Töö käik: 1. Pipeteerisin plaadi viide auku 100 μl broomfenoolsinist 2. Pipeteerisin lisaks 50 μl, 5 μl, 1 μl ja 0,25 μl äädikhapet. Segasin. Lahuste värv muutus sõltuvalt äädikhape mahust. 3. Kasutades kõige väiksemat pipetti pipeteerisin blotipaberile oma nimi ja muster. 16. Järeldus: täpid on erineva raadiusega (suurusega), kuna pipeteeritud lahuste maht oli erinev, sõltuvalt mustrist
heemile on värviline (kromoproteiin), max = 550 nm. Kontsentratsioon 3 mg/ml. Proovi lahustina kasutatakse 0,15 M NaCl lahust 0,5 M sahharoosi lisandiga. Sahharoosi (Mr = 342) lisatakse tiheduse suurendamiseks, et proov moodustaks kolonni sisestamisel geeli pinnale vooluti alla õhukese kihi. Kolonni voolutamine toimub 0,15 M NaCl lahusega. Variant B kolmekomponentne proov. 1. Dekstraansinine (Mr = 2 · 106), 2 mg/ml 2. Broomfenoolsinine (Mr = 670), 40 g/ml 3. Uuritav valk, 10 mg/ml Proovi lahustina ja kolonni elueerimiseks võib kasutada 0,15 M NaCl lahust. Kui kasutatav kolonn on eelnevalt kaliibritud valkudega, milliste molekulmassid on teada, siis on võimalik uuritavas proovis sisalduvat valku molekulmassi järgi kindlaks teha. Olgu näiteks toodud variant, kus uuritava segu lahutamine on läbiviidud Sephadex G-100 kolonnis. Valkude jaoks on selle geeli eksklusioonipiirkond umbes 100 000. Sellisel juhul
Aseta geel foreesivanni. 7. Lisa foreesipuhvrit, et see kataks geeli umbes 2-3 mm. 8. Lisa DNA proovile umbes 0,2 mahu ulatuses värvainet (loading dye). 9. Kanna proov aeglaselt hambasse. Kindlasti kanna geeli äärmistele radadele ka suurusmarker. 10. Sule foreesivann kaanega ja lülita vool sisse. Voolupinge peaks olema 1-5 V/cm (distants positiivse ja negatiivse elektroodi vahel). Elektroodi juurest hakkab eralduma mulle ja broomfenoolsinine liigub mõne minuti jooksul hambast geeli. Forees kestab seni kuni värvid on liikunud nõutavale kaugusele hammastest. 11. Kui DNA proov ja värvid on liikunud nõutavale kaugusele, lülita vool välja, võta geel vannist välja 12. Aseta geel sisaldavasse vanni ja värvi umbes 10-15 minutit. 13. Tulemuste dokumenteerimine toimub digitaalselt IV korrusel. Praktiline töö ÜLESANNE 1. Teostada elektroforees eelmises praktikumis valmistatud PCR reaktsiooni produktidega.
annaabi.ee 
