(komponendid, temperatuurid, aparatuur, metoodika, eesmärk, tüübid). 2:6-10. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on on tänapäeva molekulaarbioloogide üks põhilisi meetodeid, mis võimaldab sünteesida suurt hulka identseid DNA molekule in vitro. PCR metoodika väljatöötamine sai võimalikuks, kui avastati kuumaveeallika bakter, kes suurepäraselt elab ja paljuneb üle 70-kraadises vees. Tema DNA-polümeraasi kasutatakse PCR- meetodis, mis võimaldab in vitro paljundada ehk amplifitseerida konkreetset, uuritavat DNA fragmenti. See meetod on loodud ülilihtsal põhimõttel: temperatuuride muutmisel. Selleks on PCR-masin, millesse asetatakse 0,2 ml-sed tuubid DNA-proovidega ja käivitatakse programm, mis automaatselt kuumutab-jahutab kindlal temperatuuril kindlate ajavahemike järel. (PCR) vajalikud komponendid (joonis 5.2.2.4.): DNA proov, mida uuritakse; DNA-plümeraas, täpsemalt on see kuumaveebakteri nimest tulenev Taq-polümeraas;
(lõppkontsentratsioon 240µM) 1,0µl Pärisuunalist praimerit Polümeraasi seondumiseks 5´ (lõppkontsentratsioon 0,5µM) poolele 1,0µl Vastassuunalist praimerit Polümeraasi seondumisesk 3´ (lõppkontsentratsioon 0,5µM) poolele 0,2µl template-DNA sisaldab regiooni, mida tahetakse (lõppkontsentratsioon praimerite abil amplifitseerida 0,25ng/µl) 0,1µl HotFIRE Pol Polümeraas (0,5U) Termostabiilne polümeraas, sünteesib 5´-3´sidemeid. Arvutused: Kokku soovime saada 20µl 3 1 Polümeraas: ×20=2 µ l Magneesiumkloriid: 10 ( 2,5× 10−3 ) ×(20 × 10−6) = 2µl 25 ×10−3
T3 51 kraadi, T7 53 kraadi 4.2) Millise osa PCR produktist moodustab plasmiidi järjestus? Tee see kindlaks kasutades pBS KS+ plasmiidi kaarti (eelnevalt antud), nn. "multiple cloning site" järjestust kasutades. 160-170 nukleotiidi koos mõlemate praimerite ja vektoritega. 4.3) Arvuta Wallace reegli abil praimerite X: 5'-AAGATGCCATGAAGATGCCA-3' ja Y: 5'- TGGCATCTTCATGGCATCTT-3' sulamistemperatuurid. Milline näeb välja PCR profiil, kui nende praimeritega amplifitseerida 250 bp pikkust fragmeti. Arvesse tuleb võtta, et Taq polümeraasi kiirus on ligikaudu 1000 nt/min. Mõlema tulemus 58-5=53 kraadi.denaturatsioon 94 kraadi, ekstensioon 72 kraadi, hübridisatsioon 53 kraadi juures. ¼ minutist ehk lasta 15sek. 13 4.4) Kui 100 l PCR mastermix kohta panna 8 l 25 mM MgCl2, 10 l 2 mM dNTP ja 5 l mõlemat
Sellisel juhul ongi nende sulamistemperatuur vajalikus vahemikus. 3. DNA süntees. Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3' otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Protseduur toimub 72 °C juures ning selleks kasutatakse termostabiilset Taq polümeraasi. Neid tsükleid korratakse 2030 korda, et amplifitseerida piisav arv DNA molekule. 45. Kuidas on polümeraasi ahelreaktsioon muutnud geenitehnoloogiat? PCR on muutnud DNA kloonimise muutnud palju kiiremaks ja lihtsamaks. PCR abil saab haiguste diagnostikat teha palju väiksema koguse DNA-ga. Üheks tähtsaks PCR-i kasutusalaks on võimaliku AIDS-i nakatumise diagnoosimine väga varajases staadiumis juba enne antikehade teket. Tänu PCR-ile
madalam, siis sobiv temperatuur antud PCR reaktsiooniks on 56-5=51 oC. 4.2) Millise osa PCR produktist moodustab plasmiidi järjestus? Tee see kindlaks kasutades pBS KS+ plasmiidi kaarti (eelnevalt antud), nn. "multiple cloning site" järjestust kasutades. T7 promootorist SAC2 ni ja SAC2-st T3 promootorini. 4.3) Arvuta Wallace reegli abil praimerite X: 5'-AAGATGCCATGAAGATGCCA-3' ja Y: 5'- TGGCATCTTCATGGCATCTT-3' sulamistemperatuurid. Milline näeb välja PCR profiil, kui nende praimeritega amplifitseerida 250 bp pikkust fragmeti. Arvesse tuleb võtta, et Taq polümeraasi kiirus on ligikaudu 1000 nt/min. Praimerite X ja Y sulamistemperatuurid on : (9*4+2*11) =58 oC. 4.4) Kui 100 l PCR mastermix kohta panna 8 l 25 mM MgCl2, 10 l 2 mM dNTP ja 5 l mõlemat praimerit kontsentratsiooniga 100 ng/l, siis milline on MgCl2, dNTP ja praimerite lõplik kontsentratsioon? MgCl2 kontsentratsioon: (25/100)*8=2mM/µl dNTP kontsentratsioon: (2/100)*10=0,2 mM/µl
oleks unikaalse järjestusega. Genoomis on palju kordusjärjestui ning vahel on nad oluliseks segavaks teguriks, kui tahta tekitada praimerit, mis seonduks ainult ühte kohta genoomis. Kolmandaks piiravaks teguriks on paljundatavte DNA fragmentide pikkus. Tüüpiliselt on PCR-iga võimalik paljundada 100-10 000 aluspaari pikkuseid DNA lõike, nii et kui meid huvitav DNA piirkond on sellest pikem, eu saa seda ühe pika fragmendina taolisel moel amplifitseerida. PÕHIMÕTE: Iga tsükkel koosneb kolmest etapist, kus esimesena DNA ahelad denatureeritakse (1 → 2), seejärel võimaldatakse praimeritel seonduda kindlatele kohtadele DNA ahelal (2), mis paarduvad komplementaarsuse põhimõttel kummalegi poole kopeeritavat ala. Kolmanda etapina viib polümeraas läbi 5'--> 3'suunas praimerite pikendamise (3). Käesolevat tsüklit korratakse mitmeid kordi, mille tulemusena saadakse lõpus
termineerunud erinevatest kohtadest. Sünteesitud DNA fragmendid lahutatakse polüakrüülamiidgeeli. Geelelektroforeesi tingimused on sellised, et sünteesitud DNA fragmendid eristuvad geelist üksteisest ühenukleotiidse täpsusega. Mida ühem onfragment, seda kiiremini liigub ta geelis. See võimaldab DNA fragmentide mustrist lugeda välja DNA lõigu nukleotiidset järjestust. 46. Polümeraasi ahelreaktsioon. PRC meetod võimaldab spetsiifiliselt amplifitseerida(saada DNA paljundamisel koopiaid) suvalist DNA järjestust. PRC rakendamiseks on vaja teada amplifitseeritavast DNAst primaarjärjestust paljundatava DNA piirkonna mõlemast otsast.PRC toimub kolmeetapiliselt: 1. Amlifitseeritava DNA denatureerimine emperatuuri toimel (92-95 kraadi juures) 2. DNA renatureerimine temperatuuri langetamisel ülehulgas lisatud sünteetiliste oligonukleotiidsete praimerite juuresolekul, millest üks on komplementaarne amplifitseeritava
Need avastused ja geneetilise koodi deshifreerimine said aluseks molekulaargeneetika sünnile. Uute molekulaarsete meetodite väljatöötamine 70-ndatel ja 80-ndatel aastatel on võimaldanud kasutusele võtta rekombinantse DNA tehnoloogia, täiustusid meetodid, mis võimaldavad määrata nukleiinhapete primaarstruktuuri. 1985-nal aastal Kary Mullise poolt väljatöötatud PCR (polümerase chain reaction) meetod võimaldab lühikese ajaga amplifitseerida spetsiifilisi DNA segmente väga väikesest algmaterjali kogusest. Uute meetodite arsenal kasvab pidevalt, võimaldades üha täpsemalt selgitada geeneetiliste protsesside toimumist molekulaarsel tasemel. Ka geeni definitsioon on alates Mendeli poolt kasutatud ?pärilikkuse ühikust? (siis veel terminit ?geen? ei tuntudki) pidevalt täiustunud. MENDELI SEADUSED Põhipostulaadid:
Need avastused ja geneetilise koodi deshifreerimine said aluseks molekulaargeneetika sünnile. Uute molekulaarsete meetodite väljatöötamine 70-ndatel ja 80-ndatel aastatel on võimaldanud kasutusele võtta rekombinantse DNA tehnoloogia, täiustusid meetodid, mis võimaldavad määrata nukleiinhapete primaarstruktuuri. 1985-nal aastal Kary Mullise poolt väljatöötatud PCR (polümerase chain reaction) meetod võimaldab lühikese ajaga amplifitseerida spetsiifilisi DNA segmente väga väikesest algmaterjali kogusest. Uute meetodite arsenal kasvab pidevalt, võimaldades üha täpsemalt selgitada geeneetiliste protsesside toimumist molekulaarsel tasemel. Ka geeni definitsioon on alates Mendeli poolt kasutatud ?pärilikkuse ühikust? (siis veel terminit ?geen? ei tuntudki) pidevalt täiustunud. MENDELI SEADUSED Põhipostulaadid:
mtDNA on kõikides aeroobsetes eukarüootsetes rakkudes, kus mitokondrid vastutavad energiavahetuses oksüdatiivse fosforüleerimise eest (hingamine ja ATP tootmine). mtDNA genoom on rõngasjas ja sageli superspirliseerunud (mõnedel seentel ja ainuraksetel siiski ka lineaarne). On GC rikas, seepärast tuuma DNAst kerge eraldada tsentrifuugimisel. mtDNAs puuduvad histoonide sarnased valgud. Kuna mitokondreid on rakus palju, siis nende koopiate arv eraldamisel suur ja neid on kerge amplifitseerida PCRiga. mtDNA suurus on väga varieeruv. mtDNA genoomi replikatsioon: Sarnane tuuma DNA replikatsiooniga (poolkonservatiivne) kuid tal on oma spetsiifiline DNA polümeraas. Toimub kogu aeg, mitte ainult S faasis, nagu tuuma DNA. Mittekodeeriv kontrollpiirkond moodustab lingu, mis funktsioneerib kui replikatsiooni piirkond. Mitokondriad kui organellid paljunevad, mitte ei moodustu de novo. mtDNA genoom: mtDNA geenid on tRNA, rRNA ja tsütokroom oksüdaasid, NADH-dehüdrogenaas, & ATPaasid .
10. Mis on alleelid ja kuidas nad tekivad? Mis on lookus? Alleelid - uhe ja sama geeni erinevad seisundid, mis asetsevad homoloogiliste kromosoomide identsetes piirkondades. Koosnevad nukleiinhappest. Alleelid tekivad üksteisest geenmutatsioonide tagajärjel. Paaris olevad alleelid lahknevad ühekaupa sugurakkudesse. Lookus - koht kromosoomis, kus asub geen voi geenid. 11. DNA srmejäljed, PCR reaktsioon. Geeniteraapia. PCR reaktsioon - meetod, mis vimaldab lühikese ajaga amplifitseerida e. paljundada spetsiifilisi DNA segmente, kasutades väga vähest algmaterjali. DNA srmejäljed - saadud DNA varieeruvuse alusel saadakse nn. DNA srmejäljed. Geeniteraapia - pärilike haiguste krvaldamine asendades defektsed geenid normaalsete geenidega. 12. Mis on telomeer, tsentromeer, kääviniit, sünapsis, mikrotuubulid, kinetohoor? Telomeer - kromosoomi lpp-piirkond. Tsentromeer - kromosoomi piirkond, mis hoiab koos kromatiide ning sisaldab mitoosi- vi meioosikäävile kinnitumise kohta
Need avastused ja geneetilise koodi deshifreerimine said aluseks molekulaargeneetika sünnile. Uute molekulaarsete meetodite väljatöötamine 70-ndatel ja 80-ndatel aastatel on võimaldanud kasutusele võtta rekombinantse DNA tehnoloogia, täiustusid meetodid, mis võimaldavad määrata nukleiinhapete primaarstruktuuri. 1985-nal aastal Kary Mullise poolt väljatöötatud PCR (polümerase chain reaction) meetod võimaldab lühikese ajaga amplifitseerida spetsiifilisi DNA segmente väga väikesest algmaterjali kogusest. Uute meetodite arsenal kasvab pidevalt, võimaldades üha täpsemalt selgitada geeneetiliste protsesside toimumist molekulaarsel tasemel. Ka geeni definitsioon on alates Mendeli poolt kasutatud "pärilikkuse ühikust" (siis veel terminit "geen" ei tuntudki) pidevalt täiustunud NUKLEIINHAPPED 1868. aastal isoleeris Johann Friedrich Miescher rakkudest happelise ühendi ning nimetas selle nukleiiniks.
annaabi.ee 
