9. Lõpetasin elueerimise, kui eluaadi summaarne maht oli sama, mis arvutuslik kogumaht. Proovide analüüsimine Selleks, et teada saada aine kontsentratsiooni mõõtu, mõõtsin kõikide proovide (va täiesti värvusetute) optilise tiheduse ehk absorbtsiooni. Optilist tihedust määratakse aine neeldumis- maksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetri abil. Ainete lainepikkused: · Sinine (Dekstraansinine) 670nm · Pruun (Müoglobiin) 410nm · Kollane (DNP- aspartaat) 360 nm Fraktsiooni Elueerumismah Absorbtsioo nr t n (V, ml) (A) Eeljooks 33 0 Dekstraansini ne, 670nm 1 35 0,0389 2 37 0,2726 3 39 0,1953 4 41 0,0406 5 43 0,0092 Müogobiin, 410nm
Peroksiid redutseerub, tekib vesi. Kasutades substraati, mis oksüdeerudes annab värvilise produkti, saab seda jälgida spektrofotomeetriliselt. Antud töös kasutatakse värvilise substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II) ehk kollast veresoolt. 2+ 3+ Reaktsiooni käigus Fe oksüdeerub Fe -ks, sellega kaasneb H2O2 redutseerumine. Tekib punane veresool, mis annab lahusele kollase värvi ja on detekteeritav lainepikkusel 410nm. TÖÖ KÄIK: Tundmatuks prooviks oli viinamari, kust uhmerdasin välja umbes 1 ml mahla. Sellest 0,5 ml lahjendasin kolvis 200 ml destilleeritud veega. Glükoosi lahusest, mis oli saadud õppejõu käest, tegin kolm lahjendust. Esimesse katseklaasi pipteerisin 2,5 ml glükoosilahust ja 7,5 ml vett. Seejärel võtsin samast katseklaasist 5ml proovi ja lisasin 5ml vett. Kolmandasse katseklaasi võtsin 5ml teisest katseklaasist proovi ja lisasin juurde 5ml vett. Tööreaktiivi koostis:
Katseklaasidesse nr.4,5,6 pipeteerin igaühte 1ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust. Igasse katseklaasi pipeteerin 3ml tööreaktiivi ja loksutan kohe,et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Fikseerin reaktsiooni alguse aeg ja katseklaase hoian 20 minutit toatemperatuuril.Reaktsiooni tulemusena glükoosi sisaldavad lahused värvuvad tekkiva K-heksatsüanoferraat(lll) toimel kollaseks. 20 minuti pärast mõõdan spektrofotomeetriga lainepikkusel 410nm lahuste optilise tiheduse väärtused. Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine Katse tulemused: 1) 0-proob 0,059ABS 2) Uuritav lahus 0,173ABS 3) Uuritav lahus 0,170ABS 4) Glükoosi lahus 0,25mg/ml 0,196ABS 5) Glükoosi lahus 0,125mg/ml 0,130ABS 6) Glükoosi lahus 0,62mg/ml 0,106ABS Kaliibrimisgraafik: Leiame saadud sirge võrrandi valemiga: Läbiviidud mõõtmiste alusel sain, et y1=0,170; y2=0,173 ja seega ykesk=0,172.
· ühendatud fraktsioon 16,75 ml · 2ml suuruseid fraktsioone kogutakse, kuni kogu uuritav aine on kolonnist väljunud ja eluaat on värvitu Fraktsiooni analüüsimine Aine kontsentratsioon igas fraktsioonis väljendatakse lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetritel. Sinised fraktsioonid mõõdetakse lainepikkusel 670nm, pruunid lainepikkusel 410nm ja kollased lainepikkusel 360nm. Koostatakse katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine (molekulmass 2 000 000 Da), mis ei läbinud geeli poore ja väljus minimaalse elueerimismahuga. Teisena väljus müoglobiin (molekulmass 17 800 Da), mis osaliselt difundeerus geeli. Viimasena väljus DNP-aspartaat (molekulmass
kordasin veel korra. · Voolutasin kolonni 1ml/min ja kogusin fraktsioonid 2ml kaupa katseklaasidesse. · Mõõtsin kõigi fraktsioonide neeldumismaksimumid spektrofotomeeril. Eelnevalt oli kolonnist jõdnud läbi voolata 17,5ml eluaati, alates millest hakkasin fraktsioone koguma. Fraktsioonides 1-4 mõõtsin neelduvusmaksimumi sinise värvi lainepikkusel 625nm Fraktsioonides 4-13 mõõtsin neelduvusmaksimumi pruuni värvi lainepikkuse 410nm Fraktsioonides 14-24 mõõtsin neelduvusmaksimumi kollase värvi lainepikkusel 360nm Fraktsiooni nr Elueerumismaht V, ml Optiline tihedus, A 1 19,5 0,009 2 21,5 0,153 3 23,5 0,152 4 25,5 0,033 5 27,5 0,6083 6 29,5 1,7289 7 31,5 2,1229
reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraat(II) ehk kollast veresoola. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasneb peroksiidi redutseerumine veeks. Tekkic kaaliumheksatsüanoferraat(III) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410nm. Selle töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuvilja vm taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse kaaliumheksatsüanoferraat(II). 2. Töö käik Uuritava lahuse ettevalmistamine: mee lahus Mee lahus valmistatakse kuuma destilleeritud veega, et soodustada suhkrute ja mees
· Elueeritud segus oli: 1) Dekstraansinine. Absorbeerib lainepikkusel 670 nm(sinie joon kromatogramil). Temal on sinine värvus ja ta väljub kolonnist esimesena, sest dekstraansinine on kõrgmolekulaarne(suured molekulid), mille tulemusena molekulid ei mahu geeligranulite pooridesse ja liikuvad kiiresti nende vahel. Kromatogrammi järgi me näeme,et dekstraansinise elueerimismaht V1 min=24ml 2) Müoglobiin. Absorbeerib lainepikkusel 410nm. Pruun värvus. Väljub teisena, kuna tol on väiksem molekulmass kui dekstraanil.V2=34ml 3) DNA DNP-Aspartaat. Absorbeerib lainepikkusel 360 nm. Kollane värvus. Väljub viimasena, kuna temal on kõige väiksem molekullmass, ja molekulid hästi mahuvad pooridesse, mis pidurdavad nende liikumist.V3max=74 ml.... Kui kõik on õigesti tehtud siis V3max ja arvutatud Vxmax peavad kokku langem. Arvutatud Vxmax on 74,9 ml....
kollasele 360 nm. Tulemused Tabel 1. Mõõtmistulemused Esmane fraktsioon 25 ml Fraktsiooninr Elueerimismah Optiline tihedus (D) Lainepikkus t 1 27 0,005 670nm 2 29 0,145 3 31 0,411 4 33 0,349 5 35 0,165 6 37 0,037/0,620 410nm (segafraktsioon) 7 39 0,887 8 41 0,884 9 43 0,719 10 45 0,515 11 47 0,330 12 49 0,198 13 51 0,110 14 53 0,062 15 55 0 16 57 0
155 34 2 0.798 35 2 0.493 36 2 0.259 Kromatogramm 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 C.Kromatogrammil näitan: Kõigepealt märkisin tabelisse värvidega, mis lainepikkustel neid mõõdetud sai. Sinised-670 nm, prune-410nm ja kollaseid- 360nm. Esimese kolonnist väljuva aine (esimene kõver kromatogrammil) , dekstraansinise, väljumismaht on minimaalne elueerimismaht Vv=Vx;min. See võrdub kolonni vaba mahuga ehk graanulitevahelise mahuga. Ta väljus esimesena, sest tema molekulid on liiga suured ning ei mahu geeli pooridesse, tema molekulmass on suurim. Eluaadimaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooga fraktsiooni väljumiseni on Vx;min=Vv=26ml(ühendatud fraktsioon)+6ml=32ml.
optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest. Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetritel. Ning alustasin mõõtmisest lainepikkusega 670nm. Esiteks mõõtsin kolbide optilist tihedust sinise värvusega, ehk dekstraansinisega. Ning kui adsorbtsiooni näitaja jäi võrdseks nulliga, siis reguleerisin spektrofotomeetri nii, et lainepikkus saaks võrdseks 410nm-ga. Kui adsorbtsiooni näitaja jälle sai võrdseks nulliga, reguleerisin lainepikkust nii, et oleks 360nm. Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. Fraktsiooi nr Elueerimismaht Optiline tihedus Ühendatud fraktsioon 23 cm3 0 1 25cm3 0,283
optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest. Absorptsiooni mõõtsin spektrofotomeetritel. Ning alustasin mõõtmisest lainepikkusega 670nm. Esiteks mõõtsin kolbide optilist tihedust sinise värvusega, ehk dekstraansinisega. Ning kui adsorbtsiooni näitaja jäi võrdseks nulliga, siis reguleerisin spektrofotomeetri nii, et lainepikkus saaks võrdseks 410nm-ga. Kui adsorbtsiooni näitaja jälle sai võrdseks nulliga, reguleerisin lainepikkust nii, et oleks 360nm. Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. Fraktsiooi nr Elueerimismaht Optiline tihedus Ühendatud fraktsioon 23 cm3 0 1 25cm3 0,283
annaabi.ee 
