Vxmax = Vt - Vg Aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja mille elueerimismaht on antud kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = (Vx Vxmin)/(Vxmax Vxmin) , kus 0 < Rf < 1 Fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammi. Käesolevas töös kasutatakse konstentratsioonide kindlakstegemisel spektrofotomeetrilist meetodit. Töö käik Antud töös kasutan Sephadex G-75 geeli, mille k=0,1. Mõõdan geelisamba kõrguse L=15,5 cm ja sisediameetri d=2,7 cm. Siit saan arvutada geelitäidise kogumahu Vt. d Vt = S p × L = × ( 2 )2 × L 2,7 cm Vt = × ( 2 )2 × 15,5 cm = 88,7 cm3 Siit saan arvutada geelimaatriksi mahu Vg. Vg = k × V t Vg = 0,1 × 88,7 cm3 = 8,87 cm3 = 8,9 cm3 Ning kolonni maksimaalse elueerimismahu Vxmax Vxmax = Vt - Vg
Oluline klassifikatsiooni aspekt on ka aktiivtsentri ehitus ja sellest tulenev toimemehhanism, 4 peamist rühma on: seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasid. Proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ning trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel, milleks kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. TKÄ toimel sadestuvad lahusest tervikvalgud ning kõrgmolekulaarsed peptiidid, sademe eraldamisel jäävad lahusesse alles aga vabad aminohapped ning madalmolekulaarsed peptiidid nende kontsentratsioon määratakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse algusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped nagu Tyr, Trp ja Phe omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkusel 270-280 nm ning selle tõttu on nad kergesti tuvastatavad spektrofotomeetriliselt.
mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge nii, et selle alla mahuks katseklaas. Täidise kõrgus on tavaliselt 25- 30 cm, täidise kohal umbes 3-4 cm kõrgune vaba eluendi kiht. Eluendi lisamine ja fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. 2. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine: · kontrollitakse ja vajadusel korrigeeritakse kolonni asendit · märgitakse üles Sephadex täidise mark ja pundumistegur k · mõõdetakse geelsamba kõrgus L ja diameeter d · arvutatakse täidise kogumaht Vt · arvutatakse geelmaatriksi maht Vg = k*Vt ja maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg · arvutatakse fraktsioonide arv n, kui ühe fraktsiooni mahuks võetakse 2 ml,
kolonnist, eluendi reservuaarist ja fraksioonikogurist ehk kollektorist. Töös oli kasutatud klaaskolonne, mis juba eelnevalt oli täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas. Täidise krgus kolonnides on 2530 cm. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutati spektrofotomeetrilist meetodit. TÖÖ KÄIK Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine kolonni täidis Sephadex G75, k=0,1 Geelisamba täidise kõrgus L=24 cm, diameeter d=2 cm Täidise kogumaht Vt = ·(d:2)2·L = 3,14· (2:1)2·24 = 75,40 cm3 = 75,40 ml Geelimaatriksi maht Vg = k·Vt = 0,1·75,40 = 7,54 ml, kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg = 75,407,54 = 67,86 ml. Fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; n = V xmax/2 = 67,86/2 = 33,93
dekstraangeeliga Sephadex. Väiksema poorsusega, st tihedamad, Sephadex'i margid on mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni suhteliselt kiiret voolutamist. Kolonni alumine osa on täidetud klaasvillaga, et täidis ei saaks välja voolata. Kolonn on statiivi küljes ning selle alla peab mahtuma katseklaas. Täidise kõrgus on tavaliselt 25-30 cm ja täidise kohal on tavaliselt 3-4 cm eluendi kiht. Ainete kontsentratsioonide kindlaks määramiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. Katse käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kolonni täidis: Sephadex G-75, mis on dekstraantäidis, fraktsioneerimispiirkonnaga 3000- 80000 daltonit. Kolonni iseloomustav tegur k=0,1 Geelisamba kõrguseks mõõtsin: L=18 cm Geelisamba diameetriks mõõtsin: d=2,8 cm r=1,4 cm Arvutan täidise kogumahu: Vt=r2**L Vt=1,42*3,14*18=110,78 cm3 Arvutan geelimaatriksi mahu: Vg=k*Vt Vg=0,1*110,78=11,08 cm3
asetseva eluendi reservuaariga siis algab kolonni väljavoolukraani avamisel kohe eluendi kogumine. Meie töös kasutame: klaaskolonn, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Kolonn on kinnitatud statiivi külge ja selle alumine osa on täidetud klaasvillaga.Täidise kõrgus kolonnides on tavaliselt 25-30 cm, täidise kohal reeglina 3-4 cm paksune vaba eluendi kiht. Eluendi lisamine kolonni ja fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Antud töös kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. Töö käik: Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine ·Kontrollisin kolonni vertikaalsust, asendit korrigeerida polnud vajalik. ·Kolonnis oleva Sephandex'i mark: Sephandex G75 fraktsioonimispiirkond 3000-80000 D, k=0.1 (väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest) ·Mõõtsin geelisamba kõrguse L ja diameetri,kasutades sobivat joonlauda.n L=28cm; d=2.2cm.
Sephadex'i margid, mis on samas ka mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni kiiret voolutamist. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine, kooniline osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatudstatiivi külge sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse käesolevas töös spektrofotomeetrilist meetodit Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollisin kolonni vertikaalsust. · Märgisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k, mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest ning sain teada et see on võrdne 0,1-ga. · Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrgus L ja ja diameeter d, kasutades sobivat joonlauda. Sain, et L=31cm ja d=1,8 cm · Arvutasin täidise kogumaht Vt
Sephadex'i margid, mis on samas ka mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni kiiret voolutamist. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine, kooniline osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatudstatiivi külge sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse käesolevas töös spektrofotomeetrilist meetodit Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollisin kolonni vertikaalsust. · Märgisin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k, mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest ning sain teada et see on võrdne 0,1-ga. · Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrgus L ja ja diameeter d, kasutades sobivat joonlauda. Sain, et L=31cm ja d=1,8 cm · Arvutasin täidise kogumaht Vt
Kolonn on kinnitatud statiivi külge sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas. Täidise krgus 50 kasutatavates kolonnides on tavaliselt 2530 cm, täidise kohal on reeglina 34 cm paksune vaba eluendi kiht. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse käesolevas töös spektrofotomeetrilist meetodit (vt 2B. Spektroskoopilised meetodid). Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kontrollitakse kolonni vertikaalsust ja vajadusel korrigeeritakse kolonni asendit. · Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda ise- loomustav tegur k, mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest.
annaabi.ee 
