pakib DNA kokku ja interakteerub membraaniga ja difundeerub läbi membraani. 3. Millised elemendid peavad olema eukarüootses ekspressioonivektoris? Loomarakkudele mõeldud ekspressioonivektor (plasmiid) sisaldab: 1.komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (prokarüootset replikatsiooni alguspunkti, antibiootikumi resistentsusgeeni); 2.kloneerimisala (MCS) erinevate restriktaaside lõikekohad; 3.uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul); 4.reportergeeni (GFP, lutsiferaas, lacZ jt.) või märgise (tag; FLAG, myc, V5, GFP) järjestust. 5.eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust (SV40); 6.selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti. Praktiline töö III Immuunotsütokeemia 1. Mille poolest on erinevad monoklonaalsed ja polüklonaalsed antikehad? Mka reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis, on väga spetsiifilised 2. Mis on epitoop? Too välja kaks erinevat tüüpi epitoopide rühma ja kirjelda
allavoolu, on tihti rakutüüp-spetsiifilised, omades aktiivsust vaid kindlates rakutüüpides. Missuguseid analüüsimeetodeid kasutatakse enhanceralade tuvastamiseks? Linker-skaneerivat mutatsioon- ja 5'-deletsioonanalüüsi. 7. Regulatoorsete elementide tuvastamise meetodid: 5' deletsioon analüüs 5' otsast hakatakse deletsioone tegema ja linker skaneeriv mutatsioonanalüüs analüüsitakse kattuvate mutatsioonidega geeni promootor-reporter konstruktide rühma mõõtes rakus reportergeeni ekspressioonitaset või teatud kindla mRNA sünteesi taset. Kui tase on langenud, on mutatsioon regulaatorelemendis. 8. Mis on sidumissait? Koht DNAl, kuhu seonduvad erinevad valgud ja mille poolest ta a) sarnaneb TATAbox-le, ka TATAboxile seonduvad valgud b) erineb TATAbox-st? TATAboxilt algab transkriptsioon, see on promootorjärjestus. 9. Joonista tüüpilise RNA Pol II promootori struktuur ja kirjelda faktoreid, mis sinna transkriptsiooni initsiatsiooni käigus seovad
(heat-shock transkriptsiooni faktoreid). Aktiveeritud HTSFi sidumine proksimaalsepromootori teatud järjestustele stimuleerib peatunud RNAPolII-i jätkama ahela elongatsiooni ning indutseerib kiiret re-initsiatsiooni uute RNAPolII molekulide seondumisega. 19. Kasutades LacZ reporterit pärmides S.cerevisiae ja Z. bailii selgus, et näiteks nende kahe erineva pärmi TPI geeni (kodeerib glükolüüsivalku trioosfosfaadi isomeraasi) promootorid olid funktsionaalsed mõlemas pärmis, kuid reportergeeni ekspressioonitase neilt oli mõnevõrra erinev. Transgeenne analüüs analüüs, mille jooksul geenide rühma viiakse üle ühe organismi DNAst teisse. 20. Transkriptsioonilise aktivaatori funktsionaalsed domäänid: N-terminaalne DNAd - siduv domään, mis seondub teatud DNA järjestustele, ja C-terminaalne aktivatsiooni domään, mis interaktsioonis teiste valkudega aktiveerib transkriptsiooni. 21. Peamised DNAd siduvad domäänid heeliks-pööre-heeliks (helix-turn-helix), tsink-sõrm-
katioonsed lipiidid) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). 121. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (originit ning antibiootikumi resistentsusgeeni) kloneerimisala (MCS) – paljude erinevate restriktaaside lõikekohad uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) reportergeeni (GFP, lacZ jt.) või märgise (FLAG, myc, V5, GFP) järjestust eukarüootset promootorit ja polüadenüleerimisjärjestust selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti 122. 123. pEGFP : võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud samas lugemisraamis uuritavat valku kodeeriv järjestus
Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: • komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (origini- prokarüootset replikatsiooni alguspunkt, antibiootikumi resistentsusgeeni) • kloneerimisala (MCS) – sisaldab paljude erinevate restriktaaside lõikekohti • uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) • eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust(SV40) Sageli ka: • reportergeeni (GFP, lacZ jt.) järjestus • märgise järjestus(FLAG, myc, V5, GFP) • selektsioonimarkeri ekspressioonikasset Praktikumis on kasutusel pEGFP (enhanced green flourescent protein) ekspressioonivektor, mis: • võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes • võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud
Valkude kooperatiivsel seondumisel DNA-ga ei pruugi uuritava valgu seondumissait olla DNA järjestuse põhjal ennustatav. 2. Reportergeenide kasutamine transkriptsiooni liitjärjestuste konstrueerimiseks. Promootorita reportergeen (näiteks lacZ) inserteeritakse genoomi erinevatesse piirkondadesse, nii et see satub erinevate promootorite kontrolli alla. Edaspidi on võimalik uurida, milliste geenide promootorite kontrolli all muutub reportergeeni ekspressioonitase (tõuseb või langeb) vastusena stressifaktoritele. Kromosomaalsete liitjärjestuste tekkimine võib viia märklaudgeeni aktiivsuse pärssimisele. Reportergeeni poolt kodeeritud valk võib rakus ka ise stressi indutseerida. 3. Geenikiibid (gene chips, microarrays). Tahkele kandjale viidud DNA järjestused pärinevad organismi erinevatest geenidest ning neile hübridiseeritakse rakkudest eraldatud totaalsele mRNA-le sünteesitud cDNA proov
kooperatiivse seondumise kaudu. Lisaks raskesti ennustatavusele on sellised saidid sageli ka eksperimentaalselt raskesti tõestatavad. 2. Reportergeenide kasutamine transkriptsiooni liitjärjestuste konstrueerimiseks. Promootorita reportergeen (näiteks lacZ) inserteeritakse genoomi erinevatesse piirkondadesse, nii et see satub erinevate promootorite kontrolli alla. Edaspidi on võimalik uurida, milliste geenide promootorite kontrolli all muutub reportergeeni ekspressioonitase (tõuseb või langeb) vastusena stressifaktoritele. Näiteks P-nälja korral indutseerub bakteris E. coli üle 50 geeni ekspressioonitase. Ka selle meetodi rakendamisel on probleeme. Kromosomaalsete liitjärjestuste tekkimine viib märklaudgeeni aktiivsuse pärssimisele ja nii on võimatu isoleerida promootor-reportergeeni liitjärjestusi, kus promootor kontrollib rakule eluliselt tähtsate geenide tööd. Ainus võimalus on konstrueerida genoomseid
annaabi.ee 
