Mis juhtub erinevate biomolekulidega aluselises keskkonnas? Aluselise keskkonna loob E2 lahus. Selle tagajärjes bakteriraku membraani fosfolipiidid moodustavad mitsellid ja valgud denatureeruvad. NaOH denatureerib DNA kõrgemat järku struktuurid. Kuidas tagada, et välja puhastuks vaid meid huvitav plasmiidne DNA, mitte bakteri enda genoomne DNA. Peale E2 lahuse lisamist ei tohi liiga kaua inkubeerida. Muidu denatureerub ka plasmiidne DNA mis järgmises etapis sadeneb. Laboris puhastati plasmiidset DNA’d, aga saadud plasmiidi kogus tuli liiga väike. Mida korduskatses teisiti teha? E1 lahuse lisamise järel tuleb veenduda et lahusesse ei jääks tükke. Kõik peab olema piimjas mass. Muidu need tükid ei lüüsu täielikult. Jälgida, et peale E2 12 lisamist ei inkubeeriks liiga palju. Jälgida, et etanooliga pesteks kogemata sadet kaasa ei võta! Kasvatada baktereid suuremas mahus. Praktiline töö nr. 8: Kontroll-restriktsioon
Iga üliõpilane kannab geelile kaks rada: kontroll ja restriktsioon: selleks lisada mõlemasse tuubi 10 l 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhvrit (lilla). Ühisele geelile tuleb lisada ka molekulmassi marker DNA, mille abil on võimalik määrata inserdi suurust ja kui võimalik standard DNA, mille abil saab määrata uuritava DNA kogust. 11 B: PCR (1) Kõigepealt lahjenda plasmiidset DNA-d (~100 ng/l) 50-100 korda. Lahjendus teha TE-s. Ei lahjendanud. (2) Koosta 100 l PCR reaktsioonisegu ehk nn. "master-mix" (üks segu ~10 üliõpilase peale) järgnevatest komponentidest: 62 l H2O 10 l 10x Taq polümeraasi puhvrit 8 l 25 mM MgCl2 10 l 2 mM dNTP 5 l mõlemat nii T3 ja T7 praimerit (100 ng/l) ja viimasena lisa 1 l (5 ühikut) Taq polümeraasi (hoida jääl). Seejärel kanna saadud kogus 9-10 l kaupa kümnesse PCRi mikrotuubi laiali.
(2) Analüüsi saadud restriktsioon 0,8% 1 x TBE- agaroos-geelil (valmistamist vt eelmine praktikum). Iga üliõpilane kannab geelile kaks rada: kontroll ja restriktsioon: selleks lisada mõlemasse tuubi 10 l 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhvrit (lilla). Ühisele geelile tuleb lisada ka molekulmassi marker DNA, mille abil on võimalik määrata inserdi suurust ja kui võimalik standard DNA, mille abil saab määrata uuritava DNA kogust. 9 B: PCR (1) Kõigepealt lahjenda plasmiidset DNA-d (~100 ng/l) 50-100 korda. Lahjendus teha TE-s. (2) Koosta 100 l PCR reaktsioonisegu ehk nn. "master-mix" (üks segu ~10 üliõpilase peale) järgnevatest komponentidest: 62 l H2O 10 l 10x Taq polümeraasi puhvrit 8 l 25 mM MgCl2 10 l 2 mM dNTP 5 l mõlemat nii T3 ja T7 praimerit (100 ng/l) ja viimasena lisa 1 l (5 ühikut) Taq polümeraasi (hoida jääl). Seejärel kanna saadud kogus 9-10 l kaupa kümnesse PCRi mikrotuubi laiali. (3) Lisa PCR tuubi 1 l (1-2 ng) lahjendatud DNA-d.
valgustamisel. See on hea marker geeniekspressioonil ja valgu asukoha kindlaksmääramisel. See toimib valgu markerina, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning sisseviidud DNA-valk saab seostuda just spetsiifilisse kohta rakus. Tänu fluoroessents-efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis nähtav. 53. Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma? Vastavalt soovitud omadustele tuleb vastav geen DNA-s asendada või välja lõigata. Seejärel tehakse mikrsüst plasmiidset DNA-d rakku, mis on viljaststud, kuid mille kaks erinevat geneetilist informatsiooni pole veel ühinenud (pronucleus). Saadud embrüo siirdatakse kasuemasse, kes toob transgeense järglase ilmale. 54. Mis on embrüonaalsed tüvirakud? Embrüos olevad rakud, mis on võimelised diferentseeruma erinevateks koetüüpideks ja organiteks. 55. Mille poolest erineb organismide kloonimine DNA kloonimisest? Kloonimine on identse DNA, raku või järglaskonna saamine. DNA kloonimine on teatud DNA
Valides sobivad restriktaasid, on võimalik kontrollida, kas insert on plasmiidi sisenenud õiget pidi. b. Kasutasime restriktaasi EcoRI, mis lõikab kahelt poolt EcoRV lõikamissaiti, kuhu sisestasime oma inserdi. See võimaldab tükkide pikkuste järgi määrata, kas insert on vektorisse sisenenud või mitte. Protokoll: 1. Pipeteerida: i. 5,9 l vett ii. 3 l just puhastatud plasmiidset DNA-d iii. 1 l restriktaasi 10x puhvrit iv. 0,1 l EcoRI restriktaasi (hoida külmas!) 2. Segada, fuugida ja inkubeerida 37oC 30 min 3. Valada 100 ml TAE geeli kontsentratsioon valida oodatavate produktide suuruse järgi 4. Kui 30 minutit on täis, tsentrifuugi uuesti oma kontrollrestriktsiooni, et kokku koguda kaanele kogunenud veetilgad 5. Lisa 2 l 6x DNA värvi ning pipeteeri segu agaroosgeeli hambasse 6
Plasmiidid on bakteritel olemas enamasti siis, kui ta kasvab suhteliselt mittesoodsates tingimustes, kus võivad sattuda erinevate toksiinide mõju alla vms. plasmiidides sisalduvad geenid enamasti kodeerivadki looduses just taolisi valke, mis on vajalikud ebasoodsates keskkonnatingimustes toime tulla. Geenitehnoloogias on plasmiidid olulised, sest esiteks on nad suhteliselt väiksed DNA molekulid, seega on nendega katseklaasi manipulatsioone lihtsam teha. Teiseks on plasmiidset DNA'd rakus palju ja lihtne bakteritega paljundada. Seega teeme ühest plasmiidist bakterite abil baktereis palju identseid koopiaid kloone. Kui meil on suured DNA molekulid tuhandete geenidega, milledest paljudel teame nukleotiidset järjestust js sellest aminohappelist järjestust valgus, kuid see ei ütle midagi, mida see 3
) Kuivatasin DNA sade läbipaistvaks, et vabaneda ka etanooli jääkidest Suspendeerisin 20 µl MQs 6.2 Praktikum – Kontroll – restiktsioon Kontroll teostatakse selleks, et kontrollida DNA juppide suuruste järgi, et aru saada, kas välja puhastatud plasmiid on õige. Selleks lõikame restriktaasiga inserdi vektorist. Pipeteerisin kokku 5,5 µl vett, 3 µl puhastatud plasmiidset DNA-d, 1 µl restriktaasi x10 puhvrit ja 0,5 µl EcoRl restrikaasi Segasin, fuugisin ja inkubeerisin 30 min 37 C juures, ning pärast fuugisin veel kord, et koguda kogu kondansaat Lisasin 2 µl 6x DNA värvi ja pipeteerisin segu agaroosgeelile ja sain järgmist pilti: Kui vaadata
annaabi.ee 
