· Endopeptidaasideks on näiteks savinaasi, alkalaasi omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Ensüümi toimimiseks optimaalne keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (ph~2,5), neutraalseid (pH~7,2), leelisproteaase (pH~9). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsi uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega mittesadenevaid hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilistel meetoditel. Reaktsioonil võetud proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Kasutades olemasolevaid kalibrimissirgeid leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Pidin valmistama 5 mL lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/mL
Saadud katseandmete alusel koostasin graafiku, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni sõltuvust reaktsiooni kestvuse ajast CTyr = f(t). Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel kehtib lineaarne sõltuvus, siis peaksid kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgele. Sirge ei läbi koordinaatide alguspunkti, sest kaseiinis sisaldub vähesel määral TKÄ-ga mittesadenevaid komponente ja seetõttu ka 0-proov sisaldas veidi türosiini. Katsepunktide hajumise korral viiakse neist läbi kõiki katsepunkte arvestav sirge. Aeg Optiline tihedus Türosiini kontsentratsioon (C, (min) (D) mg/ml) 0 0,2952 0,047 5 0,4346 0,067 10 0,4515 0,072 15 0,6098 0,096
C2 = 0,0804 mg/ml t2 = 5 min = 300 s C3 = 0,1066 mg/ml t3 = 10 min = 600 s C4 = 0,1308 mg/ml t4 = 15 min = 900 s Saadud katseandmete alusel koostasin graafiku, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr = f(t). Graafikult on näha, et türosiini kontsertatsioon kasvab ajas. Sirge ei läbi y-telje nullpunkti, sest kaseiin sisaldab TKÄ-ga mittesadenevaid kompenente, mistõttu on türosiini vähesel määral ka 0-proovis. Graafiku järgi on sellele ajavahemikule vastav kontsentratsiooni muut C = 0,13080,0601 = 0,0707 mg/ml. C 10 3 V1 2 V2 A= t 181 V3 g mg C türosiini kontsentratsiooni muut ml = 0,0707 t hüdrolüüsi kestus sekundites 900 s V1 hüdrolüüsisegu üldmaht ml 25 ml kaseiini + 1 ml ensüümipreparaati = 26 ml 2 TKÄ lahusest tingitud lahjendus
· Saadud katseandmete alusel koostatakse graafik, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr = f(t). Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel valitseb lineaarne sõltuvus, siis peavad kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgele. NB! Sirge ei läbi koordinaatide alguspunkti, kuna kaseiinis sisaldub vähesel määral TKÄ-ga mittesadenevaid komponente ja seetõttu ka 0-proov sisaldab veidi türosiini. Katsepunktide hajumise korral viiakse neist läbi kõiki katsepunkte arvestav sirge. Selle järgi leitakse türosiini juurdekasv CTyr valitud ajavahemikus t. Ensüümipreparaadi proteolüütiline aktiivsus A (kat/g) arvutatakse vastavalt valemile: Katse tulemused Aeg Optiline tihedus Türusiini
graafik, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr=f(t). Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja ajal vahel valitseb lineaarne sõltuvus, siis peavad kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgele, mis ei läbi koordinaatide alguspunkti, kuna 0-proov võib sisaldada veidi türosiini (kaseiinis sisaldub vähesel määral TKÄ-ga mittesadenevaid komponente). Katsepunktide hajumise korral viia neist läbi kõiki punkte arvestav sirge, misjärel leitakse türosiini juurdekasv delta CTyr valitud ajavahemikus delta t. Ensüümiks oli sarinaas. A=mikrokat/g Ctyr=0,049 0,035=0,014 t=10-5=5 V1=26 V2=5 V3=1 m=0,0075g A=(0,014*103*26*5*2)/(5*181*1*0,0075)=536,28 mikrokat/g=5,3628*10-4kat/g Ctyr=0,066-0,049=0,017 t=15-10=5 V1=26 V2=5 V3=1 m=0,0075g A=(0,017*103*26*5*2)/(5*181*1*0,0075)=651,197 mikrokat/g=6,512*10-4 kat/g
graafik, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr=f(t). Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja ajal vahel valitseb lineaarne sõltuvus, siis peavad kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgele, mis ei läbi koordinaatide alguspunkti, kuna 0-proov võib sisaldada veidi türosiini (kaseiinis sisaldub vähesel määral TKÄ-ga mittesadenevaid komponente). Katsepunktide hajumise korral viia neist läbi kõiki punkte arvestav sirge, misjärel leitakse türosiini juurdekasv delta CTyr valitud ajavahemikus delta t. Ensüümiks oli sarinaas. A=mikrokat/g Ctyr=0,049 0,035=0,014 t=10-5=5 V1=26 V2=5 V3=1 m=0,0075g A=(0,014*103*26*5*2)/(5*181*1*0,0075)=536,28 mikrokat/g=5,3628*10-4kat/g Ctyr=0,066-0,049=0,017 t=15-10=5 V1=26 V2=5 V3=1 m=0,0075g A=(0,017*103*26*5*2)/(5*181*1*0,0075)=651,197 mikrokat/g=6,512*10-4 kat/g
3.2.3 Kokkuvõte ja järeldused Uuritavaks proteaasiks oli alkalaas, mille aktiivsuseks 30°C ja 8,4 pH väärtuse juures oli 3,12 . Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel valitseb lineaarne sõltuvus, siis peavad kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgel. Sirge ei läbi koordinaatide alguspunkti, sest kaseiin sisaldab vähesel määral TKÄ-ga mittesadenevaid komponente ja seetõttu ka 0-proov sisaldab veidi türosiini. Põhjus, miks minu graafik pole lineaarne, võib peituda ebaselgetes lahustes: filtreerisin oma lahuseid 3-4 korda ning lõpetasin siis, sest vastasel juhul poleks enam olnud mõõtmistulemusteks materjali jätkunud. Siinkohal tuleb tunnistada, et minu filtrimisoskused võiksid olla tunduvalt paremad. Arvestada võib ka ajafaktorit: nagu eespool selgus, peab graafik olema lineaarne produktide kontsentratsioonide
ratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr = f(t). Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel valitseb lineaarne sõltuvus, siis peavad kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgele. NB! Sirge ei läbi koordinaatide alguspunkti, kuna kaseiinis sisaldub vähesel määral TKÄ-ga mittesadenevaid komponente ja seetõttu ka 0-proov sisaldab veidi türosiini. Katsepunktide hajumise korral viiakse neist läbi kõiki katsepunkte arvestav sirge. Selle järgi leitakse türosiini juurdekasv CTyr valitud ajavahemikus t. Ensüümipreparaadi proteolüütiline aktiivsus A (kat/g) arvutatakse vastavalt valemile: A = CTyr · 103 · V1 · V2 · 2 / t · 181 · V3 · g CTyr türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml),
annaabi.ee 
