1. Selgita ,,tömbi" ja kohessiivse otste põhimõtet (,,blunt" ja ,,sticky ends") Need otsad saadakse erinevate restriktsiooni tüüpide tulemusena. Tömbi otstele on iseloomulik komplimentaarse aluste baaspaari olemasolu. Lihtsam ligeerida vektoriga. Probleemiks DNA võib endast ümber pöörata ning valesti sisse minna. Kohessiivsed otsad ilmuvad astmelise katkestuste tõttu (trepi sarnased otsad.). Väga kergesti kleepuvad omavahel: aitavad bakteriofaagile moodustada rõbjast struktuuri. 2
(üks kummaski suunas), ampitsilliini ja kanamütsiini resistentsusgeeni ja lacZ operoni, mille lugemisraami sisestame oma inserdi. See võimaldab sini-valge meetodil välja selgitada, millistes kolooniates on tühi, millistes meie inserti sisaldav plasmiid. Vektoril on T-overhangidega otsad, mis võimaldab A-overhangidega inserti sisestada. b) PCR-i produkti on võimalik vektorisse ligeerida, kuna vektoril on T-overhang otsad ning PCR-i produktil on A-overhang otsad. T ja A on omavahel komplementaarsed, seega vektori ja inserdi ,,kleepuvad otsad" ühendatakse komplementaarsusprintsiibi alusel kõigepealt vesiniksidemetega, seejärel saab ligaas sünteesida fosfodiestersidemed. Polümeraasi valikul tuleb silmas pidada, et tegemist oleks Taq Polümeraasiga, mis lisab suure tõenäosusega 3' adeniini aluse, mis on vajalik T-A
Retroviirus – lindude leukoosi viirus Kasside leukeemia 16. Materjali kogumine viroloogiliseks ja seroloogiliseks uurimiseks Patanatoomiline lahang – muutused anatoomias ja kudedes. EKP E – küsitled omanikku K – vaatad P – lahang + L – ehk labor: * eritised – ninanõre, konjunktiviit, uriin, väljaheide, suguteede nõre, villi sisu (nt suu ja sõrataud, püsivad 24h), piimaproov, veri (vormelemendid, viiruse antigeen), koetükid hukkunud loomast. * ligeerida sooled koos lümfisõlmedega (suurenenud). * neerud – valged laigud, koos kusepõiega vaadata. Põieseinas võivad olla verevalumid. * põrn – nt tava sigade katk – serval herneterasuurused kolded (infartk). SKK – sigade klassikaline katk. Aafrika katku puhul suurenenud ja mustjaspunane. * suguorganid surnud loomal (emakas, munasarjad nt) * sperma * lindudel korjus või organid * marutaudi või prioonhaiguste puhul aju
Milleks kasutasime kloneerimisel pSTBlue-1 vektorit? Mis teeb selle eriliseks? See on meie vahevektor ja see on väga hea kuna võimaldab sini-valge skriinimist ja seal on mõlemal pool EcoRV saiti EcoRI sait, ehk seda oli väga lihtne restriktaasidega lõigata. Kas sini-valge selektsiooni kasutamisel võib õige koloonia olla ka sinine? Miks? Vahel ikka juhtub. Insert võib olla väga väike, seega lacZ jääb terveks ja koloonia värvub ikkagi siniseks. Kui tahame 5kb suurusesse vektorisse ligeerida 1000bp pikkust inserti, siis kui palju vektorit peame 50ng inserdi kohta võtma? Soovitud vektori:inserdi suhe on 1:5. Vektor : 5000bp Insert: 1000bp 10ng Kuna suhe peab olema 1:5 50ng Vektor on aga 5 korda pikem kui insert, seega on see ka 5x raskem massi poolest, ehk peame selle 10ng viiega korrutama, et saada reaalse massi. Peame võtma 50ng vektorit. Praktiline töö nr. 6: Transformeerimine
kuid kuna nad on aktiivsed erinevatel temperatuuridel, siis on efektiivsus suhtselt madal. 1.3) Kui palju tuleb võtta 1 M Tris-HCl, 5 M NaCl, 20% SDS ja 0,5 M EDTA-Na 2 lahuseid, et valmistada 1 ml 2 x PK puhvrit (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,44 M NaCl, 2% SDS, 25 mM EDTA-Na2). 400µl Tris HCl, 88µl NaCl, 100 µl SDS ja 50 µl EDTA-Na2 lahuseid 3 1.4) On vaja ligeerida 100 ng 5000 bp pikkune plasmiid ja 1000 bp pikkune insert. Mitu ng tuleb võtta inserti, et see oleks ekvivalentne plasmiidiga (arvesse tuleb võtta nende 5-kordset pikkuste erinevust)? Mitu ng tuleks inserti võtta, kui ligeermisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi? Ekvivalentne kogus oleks 20 ng (1000bp*100ng/5000bp). Tegelikkuses peaks võtma 3x rohkem ehk 60 ng.
B (blue).Yellow Tango puhvris ei ole võimalik üheaegselt lõigata Cfr421 ja Sma1 ensüümidega, kuna temperatuurid on erinevad. 1.3) Kui palju tuleb võtta 1 M Tris-HCl, 5 M NaCl, 20% SDS ja 0,5 M EDTA-Na 2 lahuseid, et valmistada 1 ml 2 x PK puhvrit (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,44 M NaCl, 2% SDS, 25 mM EDTA-Na2). On vaja võtta: 400µl Tris HCl, 88µl NaCl, 100 µl SDS ja 50 µl EDTA-Na2 lahuseid. 1.4) On vaja ligeerida 100 ng 5000 bp pikkune plasmiid ja 1000 bp pikkune insert. Mitu ng tuleb võtta inserti, et see oleks ekvivalentne(ekvimolaarne) plasmiidiga (arvesse tuleb võtta nende 5-kordset pikkuste erinevust)? Mitu ng tuleks inserti võtta, kui ligeermisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi? On vaja võtta 20 ng inserti, et see oleks ekvimolaarne plasmiidiga. Tuleb võtta 60 ng inserti ,kui
saab topsis jäänud DNA-ga töötada jätkata. 4. Praktikum – Rekombinantse plasmiidi ligeerimine Selleks, et meid huvitava amplifitseeritud DNA paljuneda, on vaja teda sisestada vahuvektorisse(plasmiidi). Selleks on vaja kokku ligeerida meie järjestus (L-Desmo) ja pSTBlue-1 vektor. Selle praktikumi käigus kasutasimi vektorit, mis oli enne lõigatud niimodi, et kleepuvad osted sisaldasid T-otsad. Taq polümeraas ei oma eksonukleaarset aktiivsust, sellega suure tõenäosusega lisab iga PCR produkti sabale lisa A-nukleotiidi. Sellega meil on ilusti kokku kleebuvad
annaabi.ee 
