Kui segusse on jäänud peale soovitava produkti muid jääke, on kontrollgeeli pildil näha peale õige pikkusega lõigu ka teisi bände. Kui aga geelil õige pikkusega bänd puudub, võib arvata, et puhastamise käigus on PCR-i produkt kadunud. Minu proov asub kolmandas positsioonis. Kontrollgeelilt on näha üks õige pikkusega (um 300 bp) lõik, mis näitab, et puhastamine on õnnestunud. Geeli analüüsil selgus, et inserdi kontsentratsioon oli umbes 13,7 ng/l. Kuna vektori ja inserdi pikkuste suhe 3851/330=11,7. Kuna vektorit oli 9 ng, saame leida vektori ja inserdi koguste suhte: (13,7*11,7)/9=17,70. See suhe on küllaltki sobiv. 3. Rekombinantse plasmiidi ligeerimine a) Kasutasime pSTBlue-1 vektorit, mis sisaldab kahte replikatsiooniks vajalikku origini (üks kummaski suunas), ampitsilliini ja kanamütsiini resistentsusgeeni ja lacZ operoni, mille lugemisraami sisestame oma inserdi. See võimaldab sini-valge meetodil välja
3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või elektroodi poole. DNA on negatiivse laenguga. Geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni elektroodi poole. 3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib? EtBr on vajalik elektroforeesil, et visualiseerida meie tulemused ehk selleks, et elektroforeesi pildil oleks võimalik eristada meie inserdi erinevaid osasid. Veel EtBr aitab otsustada millal on õige aeg fooresi lõpetada. Pärast kui DNA molekul on lahti keerdunud interakteerub EtBr lämmastikaluste vahel ja pärast fluorestseerib UV-kiirgusel. 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks? Et valmistada 40 ml 1.5% geeli on vaja 0,6 g agaroosi ja , et valmistada 80 ml 0,8% geeli on vaja 0,64 g agaroosi. 8
vahevektorisse ehk paljundusplasmiidi. Materjalid: 1,25 µl pSTBlue-1 vektor Lineaarne vahevektor, kus on origin, (16ng/µl) antibiootikumide resistentsusgeen, lacZ üksus ja AccepTor kloneerimissait. 3,75 µl PCR produkt Sisaldab inserti 1 µl 10X ligeerimispuhvrit Loob sobiva keskkonna 0,5 µl T4 DNA ligaasi (5U/µl) Ligeerib inserdi ja vektori kokku 3,5 µl MQ lahusti Arvutused: Vektor: 16/1 = 20/x x = 1,25 µl PCR produkt: 150ng/10µl=15ng/µl PCR vektrori suhe peab olema 3:1. Ehk PCR võtame 3*1,25*3,7 µl 10x puhver: 10/10 = 1 Ligaas: 5U/ µl tahame saada 2,5U ehk võtame 0,5 µl 9 MQ: 10-1,25-3,75-1-0,5 = 3,5 Töö käik:
fluorestseerub), vähendab DNA laengut (DNA muutub pikemaks ja jäigemaks). 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks? Et valmistada 40 ml 1.5% geeli on vaja 0,6 g agaroosi ja , et valmistada 80 ml 0,8% geeli on vaja 0,64 g agaroosi. 10 Töö nr 4: Rekombinantse plasmiidi inserdi suuruse määramine restriktsiooni ja/või PCR abil (kumba meetodit kasutada, otsusta eelmise töö põhjal, hinnates inserdi ligikaudset suurust) Kasutame PCR-i. Restriktsiooni ei saa kasutada, sest meie inserdid on <1000 nukleotiidi ning me ei suuda neid enam detekteerida, kui restriktaasiga lõikame. Lähteained: Rekombinantne DNA (~100 ng/l) Restriktaas Cfr42I (SacII) (10u/l, Fermentas; http://www.fermentas.com/; vt lisa)
DNA otsad. Mittekomplementaarsed üheahelalised osad tömbistatakse ehk täidetakse (Vt. DNA märkimise loengust - Klenowi fragmendi ja T4 polümeraasiga). Kõigi kolme erinevat tüüpi otstega DNA molekulide ühendamiseks kasutatakse ligeerimist s.o. DNA fragmentide ühendamist ligaasi abil. Ligaas katalüüsib kovalentse sideme moodustumist 5'-fosfaat- ja 3'- hüdroksüülrühma vahel. Enamasti kasutatakse T4 DNA ligaasi. Optimaalsete tingimuste korral on inserdi kloonimisse efektiivsus keskmiselt 1:50 st. ühel juhul siseneb insert vektorisse ja 49-l juhul toimub lihtne vektori retsirkulariseerumine. Vektori retsirkularisatsiooni vältimiseks / vähendamiseks ja kloonimise efektiivsuse tõstmiseks on mitmeid võimalusi. 1. Kasutada vektori lineariseerimiseks restriktaase, mis annavad erinevaid üheahelalisi otsi. Taoliselt on võimalik defineerida ka inserdi sisestamise suunda. 2. Vektorit töödeldakse aluselise fosfataasiga, Näit
kodeerivat lacZ operooni. Kui inserd ligeeris vektoriga kokku, siis see vektor enam ei kodeeri ensüümi, mis lõhub β- galaktosidaasi, kuna inserdi sisestamisel me rikkume selle geeni lugemisraamid. Selle alusel põhineb meie sini-valge selektsioon: bakterid lõhuvad galaktosidaasi – ei sisalda inserdi, ei lõhu – sidaldavad. Selle protsessi saab ka visualiseerida. Ligeerimiseks segasime kokku: 1,5 µl MQ vett 1 µl puhastatud PCR produkti – L-Desmo 1 µl plasmiidi, ehk pSTBlue-1 vektorit 1 µl T4 DNA ligaasi, mis on
peab säilitama oma aktiivsust kõrgel temperatuuril. Taq polümeraasid ei oma proof- reading aktiivsust (3’ – 5’ exonukleaasset aktiivsust), seega neil puudub võime kord valesti lülitatud nukleotiidi õigega asendada. See on tähtis TA-kloneerimisel, kuna meil on vaja, et moodustaksid sobivad restriktsioonisaidid edasiseks kloneerimiseks, kus 3’ otsas on adeniin ja 5’ otsas on tümidiin ning vektori ja inserdi ligeerimisel toimub A-T otste paardumine. 2. Segasin kõik vortexiga, fuugisin ning asetasin segu PCRi masinasse. 3. PCRi programmi kirjutamine: 1. 95 °C 15 minutit – polümeraasi aktiveerimine 2. 95 °C 10 sekundit – DNA ahelate denatureerimine 3. 56 °C 20 sekundit – praimerite seondumine DNAle (annealing) 4. 72 °C 3 minutit – DNA süntees 5. Kordamine alates 2. punktist 21 korda 22. Selline sünteesiaeg valitakse sõltuvalt polümeraasist
annaabi.ee 
