Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf, mis leitakse valemiga: Rf= Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin Töö käik: 1. Kolonn oli juba täidetud geeliga Sefadex G-50. Kolonni põhjas oli settinud täidist, seega võis avada väljavoolu, lastes üleliigsel vedelikul kolonnist välja tilkuda. Oluline oli mitte kolonni lasta kuivaks joosta, sest muidu tungib õhk geelikihti. Reguleerida tuli ka voolukiirus 0,5-0,8 ml/min. Hiljem, kui siniselt värvunud molekulid olid geelist läbi tulnud, võis kiirust lisada. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 0,5ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine,
Töö käik Kontrollisin kolonni vertikaalsust. Tegin vastavaid mõõtmisi (kõrgus L ja diameeter d) ja kirjutasin endale Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k. Avasin kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. Kui vedeliku tase kolonnis langes täidise pinnani, sulgesin kolonni väljavooluava (tuleb vältida, et vedeliku nivoo ei langeks geelipinnast allapoole ja õhk ei tungiks geelikihti). Sisestasin 0,5 ml uuritavat proovi «DB+Lysozyne+DnAsp» kolonni, jättes umbes 5 mm kaugusele geeli pinnast. Proov lastakse tilkuda geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks. Kui proov on sisestatud, avasin väljavool ja lisasin kiiresti pipeti abil väike kogus eluneti (NaCl). Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel lisasin suurema koguse voolutuslahust. Kui esimene värviline riba hakkas lähenema kolonni alumisele
Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf, mis leitakse valemiga: Rf= Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin Töö käik: 1. Kolonn oli juba täidetud geeliga Sefadex G-75. Avasin väljavoolu, lastes üleliigsel vedelikul kolonnist välja tilkuda. Oluline oli mitte kolonni lasta kuivaks joosta, sest muidu tungib õhk geelikihti. Kasutatud kolonnil oli automaatselt reguleeritud kiirus. 2. Kui üleliigne vedelik kolonnist eemaldatud, lisasin kolonni ülaossa pipetiga 1ml proovi. Ootasin, kuni segu lahutuma hakkas. 3. Hakkasin kolonni ülaossa puhverlahust lisama, puhverlahuseks oli 0,1 M NaCl lahus, mille pH=7,5. Segu, mida lahutasin koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. 4
Vg = 0,1 × 88,7 cm3 = 8,87 cm3 = 8,9 cm3 Ning kolonni maksimaalse elueerimismahu Vxmax Vxmax = Vt - Vg Vxmax = 88,7 cm3 8,9 cm3 = 79,8 cm3 Siit arvutan fraktsioonide üldarvu, kus ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml max Vx n= 2ml 79, 8 ml n= 2 ml = 39,9 = 40 Seejärel lasen eluenti (0,15 M NaCl lahus) kolonnist keeduklaasi, kuni eluendi tase kolonnis langeb täidise piirini. Pean silmas, et vedelikunivoo alla täidise piiri ei langeks, muidu satub geelikihti õhk, mis võib katsetulemusi mõjutada. Hoides kolonni väljavooluava suletuna, pipeteerin 0,5 ml uuritavat ainet ühtlaselt geeli pinnale ning lasen sellel valguda läbi geeli. Uuritav lahus sisaldab dekstraansinist, müoglobiini ja DNP-aspartaati (vedelik on algul rohelist värvi). Seni, kuni dekstraansinine (mis on kõige kiiremini liikuv aine) jõuab kolonni alaossa, kogun vooluti (seda pidevalt lisades) ühendatud fraktsioonina keeduklaasi
Asetasin katseklaasistatiivi vastavalt fraktsioonide üldarvule 50 katseklaasi, mis olid kalibreeritud 2 mL fraktsioonide võtmiseks. Voolutuslahuse koostis: pH=7,5; 20mM Tris/HCl; 0,15M NaCl Segu komponentide lahutamine Avasin kolonni väljavooluava ja lasin täidise kohal oleval voolutuslahusel keeduklaasi tilkuda ise samal ajal jälgides, et ma ei laseks kolonni kuivaks joosta. Vedeliku nivoo ei tohtinud langeda alla geelipinda, mis oleks õhul lasknud geelikihti tungida. Kolonni voolukiirus oli juba optimaalne, st 0,7-1,0 mL/min. Ühe 2 mL fraktsiooni kogumiseks peaks sellise kiiruse juures olema 2-3 min. Kui vedeliku tase kolonnis oli langenud täidise pinnani, sulgesin väljavooluava. Nüüd oli kolonn valmis proovi sisestamiseks. Proovi sisestamine Võtsin pipetiga 1 mL uuritavat proovi ja viisin selle kolonni. Selleks juhtisin pipeti otsa vastu kolonni seina ja lasin proovil voolata geeli pinnale nii, et geel saaks võimalikult ühtlaselt kaetud.
Eluendi koostis: 50 mM tris-HCl + 150 mM NaCl (pH = 7,5) SEGU KOMPONENTIDE LAHUTAMINE JA PROOVI SISESTAMINE 1. Avan ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et täidise kohal olev voolutuslahus (eluent) hakkaks aeglaselt kolonni alla asetatud keeduklaasi tilkuma. 2. Reguleerin kolonni voolukiiruse reguleerimisklambri abil piiridesse 0,7-1,0 ml/min. 3. Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, sulgen kolonni väljavooluava. NB! Õhk ei tohi tungida geelikihti! 4. Kasutan kalibreeritud mõõtpipetti ja viin 1 ml uuritavat proovi kolonni. 5. Lasen proovil tilkuda geeli pinnale nii, et see jaotuks seal võimalikult ühtlaselt. NB! Samal ajal on väljavooluava suletud! Praktikumis uuritavas ainete segus on kõik ained värvilised ja segu komponentide lahutamine on visuaalselt jälgitav. Uuritava segu sisaldus: dekstraansinine + müoglobiin + DNP-aspartaat KOLONNI VOOLUTAMINE: 1. Avan väljavoolu kolonnist 2
põhjustava massiülekande ja difusiooni mõju lahutuvusele oleks võimalikult väike. 51 Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kiiresti kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis uuritava proovi sisestamiseks. Kogutud lahust pole vaja säilitada ega selle mahtu mõõta. NB! Mingil juhul ei tohi lasta kolonni kuivaks joosta, st. tuleb vältida , et vedeliku nivoo ei langeks geelipinnast allapoole ja hk ei tungiks geelikihti! Proovi sisestamine Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutatakse sobiva mahuga (1 ml) mõõtpipetti või süstalt, mille otsas on tükike peenikest voolikut. Pipeti või süstlaga võetakse juhendaja poolt soovitatud kogus (reeglina 0,5 või 1 ml) uuritavat proovi ja see viiakse kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina või jättes umbes 5 mm kaugusele geeli pinnast. Proov lastakse voolata (tilkuda) geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks.
annaabi.ee 
