DNA analüüs isikutuvastamiseks kasutatakse enamasti lühikesi kordusjärjestusi ehk STR lookusi, mille alleelid erinevad üksteisest pikkuse osas, seega ei ole vaja määrata DNA nukleotiidide järjestust, vaid kopeeritud DNA lõikude pikkusi Selleks kasutatakse elektroforeesi DNA analüüs Kuna aga multipleks-PCR-i kaudu paljundatud DNA fragmendid on siiski küllalt lähedase pikkusega, kasutatakse nende täiendavaks eristamiseks fluorestseeruvaid värve, mis on ühendatud reaktsiooni läbiviimiseks kasutatavate praimeritega Kõik algselt matriitsilt kopeeritud DNA-lõigud muutuvad värviliseks ning visualiseeritakse värviliste piikidena elektroferogrammidel DNA analüüs Viimane etapp seisneb tulemuste interpereteerimises ja proovidest saadud DNA profiilide võrdlemises Kui proovidest saadud DNA profiilid on erinevad, siis ei saa need proovid pärineda samast allikast, st samalt inimeselt
- elektroluminestsentsi (helendumine staatilises elektriväljas), - triboluminestsentsi (helendumine mehaaniliste deformatsioonide toimel), - termoluminestsentsi jms. Üks universaalsemaid luminofoore on tsinksulfiid . See lihtne ja suhteliselt odav aine helendub pea kõigi võimalike mõjutuste tagajärjel. Pisut häirib tema ebameeldivalt sinakas toon, mida viimasel ajal edukalt "muudetakse meeldivamaks", segades temasse noidsamu fluorestseeruvaid värve. Tsinksulfiid on asendamatu röntgen- ja ultraviolettkiirte muundaja, ta töötab nii teleekraanil, päevavalguslampides kui radioaktiivse kiirguse indikaatorites. Energeetilisest seisukohast toimub luminestsentsi korral keha siseenergia muundumine valguseks. Siseenergia tüüp pole siin oluline, niisamuti kui selle allikad. Vaata ka http://www.obs.ee/~jaak/loengud/teine/yheksas/yheksateist.html
automaatselt kordub uuesti, mille tulemusena algne järjestus amplifitseerub eksponentsiaalselt. TMA toodab 1001000 koopiat tsükli kohta, mis tõttu 15 -30 minutiga toodab protsess 109 koopiat Chlamydia trachomatis test APTIMA CT (16S rRNA) (Gen-Probe) Mycobacterium tuberculosis Amplified MTD Direct test (rRNA) (Gen-Probe) 23. FISH (metoodika) Fluorescence in situ hybridization (FISH) Kasutab fluorestseeruvaid 16S rRNA või 23S rRNA proove ning fluorestsents mikroskoopiat tervete bakterite detekteerimiseks otse kliinilistest proovidest (veri, koed). FISH metoodikast on palju abi raskesti kultiveeritavate mikroobide analüüsil (Yersini pestis, Bartonella spp.) Samuti saab korraga detekteerida erinevaid organisme, kui kasutada erinevalt fluorestseeruvaid proove (erinev emissiooni lainepikkus) Protsess võtab aega 1-2 tundi, koos proovi fikseerimise, alusklaasile kandmise, rakkude
Seejärel eemaldatakse plaat voolutuskambrist, lastakse kuivada ja märgitakse pliiatsiga indikaatorlaikude keskpunktid. Kui tegemist ei ole värviliste ainetega, osutub vajalikuks indikaatorlaikud visualiseerimine. Olenevalt ainest, tuleb indikaatorlaikude visualiseerimiseks kasutada erinevaid meetodeid. Kui lahutatud ained UV-kiirguses fluorestseeruvad, võib nende asukohad kindlaks teha UV-lambi abil. Kui aga lahutatud ained ei fluorestseeru, võib kasutada spetsiaalseid UV-kiirguses fluorestseeruvaid kromatograafilisi plaate. Sellisel juhul jäävad indikaatorlaigud UV-lambi all nähtavaks tumedate aladena üldisel fluorestseeruval taustal (plaadil). Teatud ained muutuvad kromatogrammil tumedate laikudena nähtavaks joodikambris ilmutamisel. Ideaaljuhul on kõik segu komponendid ruumiliselt lahutatud ja paiknevad kromatogrammil selgepiiriliste väikeste laikudena. Jaotuskoefitsient, Rf (retention factor)
Vedelkristallid on nemaatilises faasis. Elektrilisel teel saab vedelkristalli struktuuri muuta. Tagumist filtrit läbinud valguslained kas läbivad kristallikihi muutumatult või veidi (90või 270) pööratult. Teist filtrit aga ei läbi enam need lained, mis on pööramata, seega nendes kohtades on ekraanil kuvatud mustad laigud. Värvide saamiseks sulatatakse jällegi kokku kolm põhivärvi, neid kõiki eraldi filtreerides, nagu näha joonisel. LCD ise ei kiirga valgust. Kasutatakse fluorestseeruvaid torusid LCD kohal, kõrval või taga. Valge difusioonipaneel LCD taga suunab valguse ringi ja hajutab ühtlaselt laiali. Liikudes edasi läbi filtrite ja vedelkristalli läheb üle poole valgusest kaduma Värvivedelkristallpaneeli konstruktsioon: 1 - luminofoorlambid, 2 - tagumine polarisaator, 3, 5 - klaasplaat, 4 - vedelkristallid, 6 - punane valgusfilter, 7 - roheline valgusfilter, 8 - sinine valgusfilter, 9 - spetsiaalfilter, 10- eesmine polarisaator LCD-kuvari tööpõhimõte:
(näit. Thermus aquaticus ja temalt saadud ensüümi nimetatakse TaqI). 8. Milleks kasutatakse kvantitatiivset polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on RT-PCRi põhietapid? Kasutatakse: viiruste kvantiteerimiseks, geeniekspressiooni kvantiteerimiseks, DNA kahjustuse mõõtmiseks, kvaliteedikontrolliks ja proovide valideerimiseks, genotüpiseerimiseks, patogeenide detekteerimiseks. Kvantifitseerimiseks, kasutatakse fluorestseeruvaid värvaineid (fluorofoore). Põhietapid: 1) PCR produkti kogust mõõdetakse pärast iga tsüklit (reaalajas) 2) Fluorestseeruvat signaali jälgitakse reaktsiooni kestel ja tema intensiivsus korreleerub moodustunud PCR produkti hulgaga 3)Seatakse mingi värvi fluorestsentsi intensiivsuse lävi ülalpool baasfluorestsentsi ja allpool maksimaalset fluorestsentsi 4)Ct (threshold cycle) – lävetsükkel, s.o tsükli number, mil fluorestsents ületab seatud läve 9
141. Fluorestsents - aine omadus emiteerida valgust pärast ergastamist kindla lainepikkusega kiirgisega. Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. 142. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. 143. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, asmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis
umbes 50%. Aga kuna signaal on, saab järjeldada, et plasmiidid on raku sees ja tranfekteerimine õnnestus. Rakkude immuunotsütokeemiline värvimine Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. • Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt • Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis
Tekib aglutinatsioon.) Kaudne aga määrab erütrotsüütide membraani antigeeni vastase antikeha olemasolu uuritavas seerumis. (Nt reesuskonflikti korral võetakse ema seerum, kuhu lisatakse Rh+ erütrotsüüte. Pestakse ära seondumata antikehad. Segule lisatakse katselooma anti-inimese antikehi. Toimub aglutinatsioon.) Lateksaglutinatsioon: pole kõige usaldusväärsem. Immuunfluorestsentsmeetod: põhineb sändvitš- või konkurentsiprintsiibil. Märgistusena kasutatakse fluorestseeruvaid osakesi. Märgistatud antikehad seostuvad antigeeniga, tekib immuunkompleks, mida saab märgistuse tõttu detekteerida. Meetodit saab kasutada erinevate antigeenide või antikehade uurimiseks fluorestsentsmikroskoobis. (Wikipeedia ütles, et enamasti kasutatakse sändvitšprintsiipi immunofluorestsentsmeetodis, et siis esmalt seostuvad uuritava komponendi antikehad tahke faasiga seondunud antigeenidega. Seejärel pestakse
annaabi.ee 
