Intensiivsus (maksimum): 132,6 Riboflaviin. Intensiivsuse maksimum: 4780,4.............................................................................. Püridoksiin. Intensiivsuse maksimum: 7418,9 Järeldused Destilleeritud vesi ei fluorestseeru, sest seal ei sisaldu flourestseeruvaid aineid. Saadav fluorestsentsspektraalkujund (SFS) kujutab ergastava valguse vee molekulidel mitteelastset hajumist ehk Ramani hajumist. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Riboflaviin fluorestseerub; püridoksiin fluorestseerub samuti ja peaaegu poole tugevamalt, kui riboflaviin. Riboflaviini intensiivsuse maksimum toimub ergastuslainepikkuses 365 nm ja emissioonilainepikkuses 530 nm. Püridoksiini intensiivsuse maksimum toimub ergastuslaine- pikkuses 320 nm ja emissioonilainepikkuses 390 nm. . . . . . . . . . . . . . . . 2. Riboflaviin+ sidrunhape, pH= 2. EEM spekter: Ergastus-ja
reagenti – EtBr. Kuna aine on orgaaniline, siis kõrgema temperatuuri juures on oht, et ta hakkab lagunema. EtBr seostub kaheahelalise DNAga ning uv-lainete all fluorestseerub oranžide viirgudena. (Suur oht! Mutageen!) Kui geel on piisavalt jahtunud, valasime geeli alusele (konstrollisime, et alus asetsetus horisontaalselt), tegime augu
maksimaalsel ergastusel. Luminestsentsi phjustavad struktuursed faktorid. Molekul peab sisaldama konjugeeritud kaksiksidemeid, millega kaasneb -elektronide delokalisatsioon ja nende vime ergastuda. -elektrone delokaliseerivad rühmad: -NH2, -OH, -F, -OCH3, -NHCH3, -N(CH3)2. Neid gruppe sisaldavad molekulid fluorestseeruvad. -elektrone lokaliseerivad rühmad: -Cl, -Br, -I, -NHCOCH3, - NO2, -COOH. Neid gruppe sisaldavad molekulid ei fluorestseeru. Aniliin fluorestseerub, nitrobenseen mitte. Molekuli jäikus suurendab fluorestsentsi, kuna energiat ei ole nii lihtne enam vnkumistele ja keskonna soojusele anda (prkumised teiste molekulidega). Viskoosus suurendab fluorestsentsi. Lahusti mju. Lahustid millede molekulid sisaldavad -Br, -I, - NO2, -NN-, kustutavad proovi molekulide fluorestsentsi, kuid vivad suurendada fosforestsentsi. Antud funktsionaalsed rühmad indutseerivad magnetvälju, mis soodustavad
Mitu korda tuleb RNaasi lahjendada? On vaja võtta 1ml RnaasA-d, 2000x. 3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või elektroodi poole. DNA on negatiivse laenguga, tuleb asetada eletroodi poole. 3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib? DNA nähtavaks tegemiseks (EtBr interakteerub lämmastikaluste vahele ning hiljem UV-valguses fluorestseerub), vähendab DNA laengut (DNA muutub pikemaks ja jäigemaks). 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks? Et valmistada 40 ml 1.5% geeli on vaja 0,6 g agaroosi ja , et valmistada 80 ml 0,8% geeli on vaja 0,64 g agaroosi. 10 Töö nr 4: Rekombinantse plasmiidi inserdi suuruse määramine restriktsiooni ja/või PCR abil
tubuliiniga. Inkubeerides sekundaarse antikehaga seonduvad sekundaarsed antikehad primaarse antikehaga. Kahekihiline reaktsioon on vajalik selleks, et poleks vaja iga primaarset antikeha fluorokroomiga konjugeerida, lisaks võimendab see signaali, kuna iga primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Alusklaasidele panemine on vajalik mikroskopeerimiseks. Sulundamislahus sisaldab DAPI-t, mis seondub DNA-ga ning fluorestseerub siniselt, see võimaldab fluorestsentsmikroskoobiga näha ka DNA-d. 14. a. Kontroll-plasmiidiga rakud: Pildil on näha siniselt DNA, roheliselt edukalt transfekteeritud rakkudes ekspresseeritud GFP ning punaselt antikehaga värvitud tubuliin. pEGFP FoxO3a-ga transfekteeritud rakud: b. Valke detekteerisin kahekihilise reaktsioonina. Primaarseks antikehaks oli Mouse anti tubuliin 1:500 ja sekundaarseks antikehaks Goat anti mouse Alexa546 1:2000. c
segada. Inkubeerida 45-60 minutit toatemperatuuril, kaitsta valguse eest. Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga. Pesta 1 kord 1 ml MQga. 3. Alusklaasidele panemine ehk sulundamine. Kirjutada alusklaasile oma nimi, kuupäev ja kasutatud antikeha. Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt. Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivatada serv vastu pehmet paberit. Asetada katteklaas (rakud allpool!) sulundamislahuse tilga sisse (vältida mulle) Lasta kuivada ja säilitada pimedas 157. 158. Kolmas päev – fluorestsentsmikroskoopia 159. Fluorestsentsmikroskoobi tööpõhimõte: ergastav valgus juhitakse läbi filtri uuritava objektini. Filter laseb läbi ainult kindla lainepikkusega valgust, mis on sobiv fluorokroomi
fluoressentsi, mida need eritavad, kui nad läbivad laseri kiirt. Sellega saab sorteerida rakke välja kindlast segu tüübist. FACS - Fluorescence activated cell sorting= rakkude sorteerimine; Seade, mis põhineb läbivoolu tsütomeetrial ja suudab leida ühe raku tuhandete teiste seast. Näiteks kui antikeha spetsiifilisele kindlale rakupinna molekulile ühendatakse fluorestsents värv, siis iga rakk, mis seda molekuli kannab, seondub antikehale ja eraldatakse teistest rakkudest, kui see fluorestseerub. Peale sorteerimist saab eraldatud rakku kasvatada kultuuris. FACS-i kasutatakse tavaliselt, et puhastada erinevat tüüpi valgeid vererakke, millest igaüks kannab oma pinnal üht või enamat eristuvad valku ja seetõttu seob monoklonaalseid antikehasid, mis on sellele spetsiifiliselt. Ainult T rakud immuunnsüsteemis omavad nii CD3 kui ka Thyl2 valke. Nende olemasolu muudab T-rakud teistest vererakkudest või põrnarakkudest kergesti eristatavaks. Varieerides
TAE halvemini kui TBE. 72 GEL-LOADING DYE. Segatakse uuritava prooviga enne geelile kandmist, et 1. suurendada proovi tihedust, mis tagab proovi vajumise geelihamba põhja; 2. värvida proov, mis lihtsustab pealekandmist. DNA detekteerimine Nukleiinhapete nähtavaksmuutmine geelil toimub peale foreesi. Selleks kasutatakse • Etiidiumbromiidi (EtBr). EtBr seondub nukleiinhapetega ja fluorestseerub UV valguses (302 nm), muutes DNA nähtavaks. Kuna ilma EtBr-ta geelis on DNA bändid teravamad ja ilusamad, siis võib geeli värvida EtBr-ga peale foreesi. Selleks hoitakse geeli 30-45 min toatemperatuuril foreesipuhvris või destilleeritud vees, kuhu on lisatud EtBr (0,5 µg/ml). Tausta helenduse vähendamiseks võib EtBr-ga värvitud geeli loputada 20 min toatemperatuuril destilleeritud vees. • Polüakrüülamiidgeelide hõbetamist
annaabi.ee 
